半岛bd体育手机客户端 及特点

弧菌(Vibrio spp.)是菌体短小，弯曲成弧形，尾部带一鞭毛的革兰氏阴性菌。弧菌属广泛分布于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。该菌引起的食物中毒经烹饪不当的海半岛bd体育手机客户端 或盐腌制品所传播。常见的为海蛰、海鱼、海虾及各种贝类，因食物容器或砧板生熟不分污染本菌后，也可发生食物中毒。该菌常年均可发生，可从自限性腹泻至中度霍乱样病症，有腹痛、腹泻、呕吐和低热，粪便多为水样，少数为血水样，恢复较快，病后免疫力不强，可重复感染，该菌还可引起浅表创伤感染、败血症等，给人体健康带来严重损害，因此弧菌检测具有重要的意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本半岛bd体育手机客户端 就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测弧菌的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供DNA模板。

2、特异性高，引物是根据人弧菌高度保守区设计,不会扩增其他细菌。

3、引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规PCR高100倍。

4、提供无传染性的PCR阳性对照，便于区分假阴性样品。

5、一管式操作，荧光PCR检测，不容易产生环境污染。

6、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研，本试剂盒足够50次20μL体系的PCR。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装
2×qPCR MagicMix	90408	0.5 mL(棕色)
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(亮黄盖)
弧菌PCR引物混合液	14-14800yw	100μL(白盖)
弧菌PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	14-14800pc	50 μL(红盖)
核酸释放剂试用装	61202	20次(1mL，绿盖)
使用手册	14-14800sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂

样品DNA。

使用方法

一、制备标准曲线样品(以10²-10⁷拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1、标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在7号管中加入5 μL阳性对照(其浓度为1×10⁸拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7、用自选方法纯化样品的DNA，本半岛bd体育手机客户端 跟市场上绝大多数核酸纯化半岛bd体育手机客户端 兼容。

8、如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送20次免DNA提取的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为PCR模板，省略了DNA提取步骤。

三、设置qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果进行定量分析，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则6个标准曲线样品只选一个做(可以选4号，其余样品不变)。以下只介绍定量分析的反应设置。

10、在标记管中按下表加入各成分：

成分	N+2个 样品管	PCR阴性对照管	标准曲线 样品管(2-7管)
2×qPCR MagicMix	10μL	10μL	各10μL
弧菌PCR引物混合液	2 μL	2 μL	各2 μL
自备10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	各2 μL
N+2个待测样品DNA模板	6 μL	不加	不加
自备超纯水	不加	6 μL	不加
第7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号)	不加	不加	各6μL(2号样到2号管，3号样到3号管…)

注:仅ABI7500、7700和7900半岛游戏平台官网入口网址 需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR半岛游戏平台官网入口网址 (如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX，则用水替代。

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据半岛游戏平台官网入口网址 不同而自行优化)。

四、荧光定量PCR反应参数

过程	温度	时间
预变性	94℃	5 min
PCR反应(40个循环)	94℃	0.5 min
	50℃	0.5 min(采集SYBR通道的荧光信号)
	72℃	0.5 min
最后延伸	72℃	10 min

五、数据处理

12、设定60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。

13、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

14、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。