半岛bd体育手机客户端 及特点

柯萨奇病毒(CoxsackieVirus)是一种肠病毒(enterovirus)，直径为28nm，核酸为单股RNA。该病毒可在多种组织细胞中增殖，并引起细胞病变。根据致病特点不同，柯萨奇病毒分为A、B两组。A组有23个血清型，B组分有6个血清型，柯萨奇病毒A型感染儿童多见，典型症状为疱疹性咽峡炎，据调查伴有口咽部疱疹和皮疹的急性热病中，79%为柯萨克A组病毒所致。柯萨奇B组病毒感染引起特征性传染性胸肋痛病。柯萨奇病毒对人类健康产生了较大威胁，因此快速灵敏检测柯萨奇病毒具有重要意义。本半岛bd体育手机客户端 就是为此目的根据探针法荧光定量RT-PCR原理开发的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。

2、引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝左右/反应。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据柯萨奇病毒RNA高度保守区设计，可以检测各A组的23个血清型和B组的6个血清型，不会跟其他病毒RNA发生交叉反应。

5、既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5各数量级。

6、本半岛bd体育手机客户端 足够50次20μL体系的探针法荧光定量RT-PCR反应。

7、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分	编号	五孔盒包装
探针法 qRT-PCR缓冲液	190504a	500μL(蓝盖)
探针法 qRT-PCR酶混合液	190504b	100μL(红盖)
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(红盖)
柯萨奇病毒探针法qRT-PCR引物-探针混合液	yp15-17200	150μL(棕色管)
柯萨奇病毒探针法qRT-PCR阳性对照(1×107拷贝/μL)	pc17200-U05876	50μL(黄盖)
使用手册	15-17200sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂

样品RNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以10E1-10⁶拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1、标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。

2、用带芯枪头分别加入45μL荧光RT-PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在4号管中加入5μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

7、如果有N个样品，**设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。

8、用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的相关RNA提取半岛bd体育手机客户端 或免提取核酸释放剂。

三、ProbeqRT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于RT-PCR阳性对照(直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管 N+2个	RT-PCR阴性对照	标准曲线样品管(1-6管)
探针法 qRT-PCR缓冲液	各10μL	10μL	各10μL
探针法 qRT-PCR酶混合液	各2μL	2μL	各2μL
柯萨奇病毒探针法qRT-PCR引物-探针混合液	各3μL	3μL	各3μL
N+2个待测RNA样本	各5μL	不加	不加
超纯水	不加	5μL	不加
第6步所得标准曲线样品稀释液(1-6号)	不加	不加	各5μL(1号样到1号管，2号样到2号管…)

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：

过程	温度	时间
逆转录	42℃	30 min
预变性	95℃	10 min
RT-PCR反应(45个循环)	95℃	15 sec
	60℃	1min(采集FAM通道的荧光信号)

五、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于45。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于40。对待测样品，如果其Ct大于或等于45则为阴性，如果小于或等于40则为阳性。如果在40-45之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于45则为阴性，如果小于40，则为阳性。