半岛bd体育手机客户端 及特点

弧菌(Vibrio spp.)是菌体短小，弯曲成弧形，尾部带一鞭毛的革兰氏阴性菌。弧菌属广泛分布于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。该菌引起的食物中毒经烹饪不当的海半岛bd体育手机客户端 或盐腌制品所传播。常见的为海蛰、海鱼、海虾及各种贝类，因食物容器或砧板生熟不分污染本菌后，也可发生食物中毒。该菌常年均可发生，可从自限性腹泻至中度霍乱样病症，有腹痛、腹泻、呕吐和低热，粪便多为水样，少数为血水样，恢复较快，病后免疫力不强，可重复感染，该菌还可引起浅表创伤感染、败血症等，给人体健康带来严重损害，因此弧菌检测具有重要的意义。荧光定量 PCR是检测传染性疾病的主流技术，本半岛bd体育手机客户端 就是以探针法荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测弧菌的通用试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品 DNA模板。

2、引物和探针经过优化，灵敏性高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据人弧菌高度保守区设计，不会跟其他微生物的 DNA发生交叉反应。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的探针法荧光定量 PCR反应。

6、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装
2×Probe qPCR MagicMix	190303	500 μL(本色盖)
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
弧菌通用探针法 qPCR引物混合液	15-14800yw	100 μL(白盖)
弧菌通用 qPCR探针	15-14800pro	50 μL(棕色管)
弧菌通用 PCR阳性对照 2.0(1×108拷贝/μL)	60908-14800pc	50 μL(红盖)
核酸释放剂试用装	61202	20次(1mL，绿盖)
使用手册	15-14800sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。

由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在 7号管中加入 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

7、如果有 N个样品，**设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数细菌 DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的细菌 DNAout或柱式细菌 DNAout。本试剂盒免费赠送 20次免 DNA提取的核酸释放剂，本半岛bd体育手机客户端 的裂解液可以直接作为 PCR模板，省略了 DNA提取步骤。

三、Probe qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线样品管(2-7管)
2×Probe qPCRMagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
弧菌通用 qPCR探针	1 μL	1 μL	各 1 μL
弧菌通用探针法 qPCR引物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2个待测 DNA模板	7 μL	-	-
超纯水	-	7 μL	-
第 7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号)	-	-	各 7 μL(2号样到2号管，3号样到 3号管…)

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程	温度	时间
预变性	94℃	5 min
PCR反应(40个循环)	94℃	30 sec
PCR反应(40个循环)	55℃	30 sec(采集 FAM通道的荧光信号)
PCR反应(40个循环)	72℃	30 sec
最后延伸	72℃	10 min

五、数据处理

12、以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

六、电泳检测

13、如果有必要电泳确认，可取 10-20 uL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为 400 bp。但电泳非常容易污染实验环境，建议不轻易采纳。