一、色谱柱使用前注意事项
色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。
1、样品的前处理
(1) 最好使用流动相溶解样品。
(2) 使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
(3) 使用0.45μm或0.22μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
(1) 流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
(2) 流动相与样品不产生化学反应
(3) 流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
(4) 流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
(5) 流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
(6) 在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。
当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
(1) 含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。
(2) 流动相要求使用0.45 μm或0.22μm滤膜过滤，除去微粒杂质。
(3) 使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
二、 色谱柱的使用及维护
1、C18等反相色谱柱使用维护
色谱柱每次使用时一定不要直接使用含无机盐的流动相！
(1) 建议首先使用含有10～30%乙腈或甲醇的高水相(不含盐)冲洗系统及色谱柱30min以上(如用水-有机相(90:10～95:5)，以0.3～0.6ml/min流速冲洗30min以上)，再更换为分析流动相。
(2) 如果流动相中含有缓冲盐，请使用过渡流动相过渡后再换分析流动相平衡；
正确使用缓冲盐，正确使用缓冲盐的目的是防止缓冲盐析出，使用缓冲盐的方法可归结为一句话：使用前要过渡，使用后要冲洗。具体方法如下：
等度条件：使用缓冲盐前用过渡流动相以1.0mL/min 流速冲洗20-30倍柱体积，然后再使用含有缓冲盐的流动相；使用后去除缓冲盐的方法是用过渡流动相以1.0mL/min 流速冲洗30倍柱体积，然后以纯有机溶液冲洗30倍柱体积保存。
梯度条件：用含有缓冲盐的流动相进行梯度洗脱之前，用与初始流动相组成相同的过渡流动相以1.0mL/min 流速冲洗30倍柱体积，再开始梯度的运行；分析完成后，再用过渡流动相以1.0mL/min 冲洗色谱柱30倍柱体积，然后以纯有机溶液冲洗30倍柱体积保存。
注意：过渡流动相是指有机相和水相比例与分析流动相相同比例，只是不含有缓冲盐。
(3) 注意事项
① 除 AQ外(可耐100%纯水)，其它反相柱应避免使用纯水相，有机相比例建议在5%以上。即使AQ也应避免长时间使用100%水冲洗。如果一定要用100%水作为流动相，请在酸性条件下使用磷酸盐缓冲液，这样能延长色谱柱寿命。
② 请注意色谱柱的pH、压力耐受范围，如超出范围或变化幅度较大会引起重现性变差、色谱柱提前劣化等问题。
③ 在有机溶剂含量少、色谱柱温度高的条件下，耐酸耐碱性能会降低。
④ 使用含有离子对试剂等表面活性剂的流动相，色谱柱的寿命会变短。
⑤ 请使用与分析柱相同填料的预柱，否则可能无法得到正常的色谱峰。
⑥ 在使用了TFA等强有机酸或碱(pH>8)的流动相之后，请使用与所选用的流动相组成相同的有机溶剂和水的混合溶液进行置换。若是一周以上的长期保存，请进一步使用乙腈进行置换，并用附带的堵头密封，保存在冷暗处。
⑦ 通常的冲洗可使用高水相-高有机相-有机相(乙腈或甲醇)依次冲洗。在甲醇、乙腈冲洗过程中，重复注入100～200μl四qi呋喃或异丙醇可有助于去除强疏水性物质。
⑧ 当供试品溶液中含有一定量表面活性剂，多次进样后，由于表面活性剂会在筛板及硅胶表面形成表面膜，导致峰变宽、拖尾甚至分叉。此时，处理方法如下：将色谱柱反向连接，不接检测器，用水-乙腈(90:10～95:5)，以0.6ml/min流速冲洗2h以上→再用100%乙腈，以0.6ml/min流速冲洗1h以上→然后正向连接好色谱柱，用水-乙腈(90：10～95:5)，以1ml/min流速冲洗1h以上→再用100%乙腈，以1ml/min流速冲洗1h以上
2、SCX 氢型阳离子交换柱。
(1) 每次使用时请一定避免直接使用含无机盐的流动相，避免盐析。可使用高水相过渡后再使用分析流动相。
(2) 离子交换柱的平衡时间较反相柱更长，请在分析前保证充分的平衡。
(3) 离子交换模式中，洗脱行为一般随以下几点发生大幅变化：
① pH；② 盐浓度；③ 有机溶剂量；④ 盐种类。
为了使样品充分离子化，流动相pH最好与样品的pKa相差 2.0以上
(4) 短期保存时，请使用含盐的水系流动相来保存；长期保存时，请用出厂(或咨询厂家)流动相纯乙腈来保存。注意拧紧柱两端自带堵头，防止溶剂挥发。
3、NH2色谱柱。
(1) 每次使用时请注意避免盐析。
(2) 弱阴离子交换模式中，一般随以下几点洗脱行为发生大幅变化：
① pH；② 盐浓度；③ 有机溶剂量；④ 盐种类。
为了使样品充分离子化，流动相pH最好与样品的pKa相差 2.0以上
(3) HILIC模式中，建议使用乙腈作为有机溶液。乙腈量增加，保留能力增大。
(4) 糖类的分析
① 请设定乙腈/水的流动相条件。乙腈的浓度越高，则对糖的保留能力越强。
② 若采用含甲醇或缓冲盐的流动相，峰会展宽。
③ 将其他公司硅胶类NH2色谱柱流动相条件中的乙腈含量增加5vol%，使用我公司NH2柱可重现几乎相同的色谱图。
④ 若将糖的水溶液作为样品注入，谱峰会展宽。请使用含乙腈50%以上的溶剂来配制糖类样品。
⑤ 曾在酸性条件下使用过的色谱柱，糖类分析的保留时间、峰形会发生变化。
(5) 离子型物质的分析
① 请设定乙腈/磷酸缓冲液且具有一定pH值的流动相条件。
② 考察流动相条件时，按照pH由高到低的顺序进行考察。如果曾经在低pH下使用，填料的表面将无法回到初始状态。
③ 有时需要长时间平衡色谱柱(24小时以上)。平衡所需时间与通液量和盐浓度紧密相关，因此，时间紧急时请提高流速，或pH不变而增加流动相的盐浓度来进行平衡。
④ 抗坏血酸的色谱峰有时会出现拖尾现象(样品氧化)。
(6) 尿囊素的分析
尿囊素在pH 2～8范围内未离子化，请使用磷酸缓冲液作为流动相进行分析。
流动相例：25 mmol/L KH2PO4/ CH3CN = 20 / 80，pH=1.5(H3PO4)
(7) 一个月以内的保存，请使用与所选用流动相组成相同的有机溶剂和水的混合溶液(不含酸、无机盐)进行置换，请避免只用水进行置换；一个月以上的长期保存，在进行了上述处理之后，请用出厂时的溶剂(乙腈)置换并保存
三、 色谱柱的再生
色谱柱经过一段时间的使用，会出现柱压升高，柱效下降，一种可能是烧结滤片被堵塞；另一种可能是大分子进入柱内， 使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能是柱头塌陷，死体积增大。您也可尝试用下面列举色谱柱再生的方法处理色谱柱。
1、反相色谱柱的再生：
用以下溶剂至少各30mL冲洗色谱柱(分析柱)
100%甲醇→100%乙腈→75%乙腈+25%异丙醇→100%异丙醇→100%二氯甲烷→100%己烷→100%异丙醇→75%乙腈+25% 异丙醇→100%乙腈
若使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱，则在重新使用反相流动相以前，必须用异丙醇冲洗色谱柱!!!
2、正相色谱柱的再生
一般情况下，极性固定相(如 Si , NH2 , Diol 基色谱填料) 的再生可以依次使用 20～30 倍色谱柱体积的正已烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇冲洗色谱柱(因异丙醇的粘度较大，冲洗过程中随时注意调整冲洗流速)，然后再以相反的溶剂顺序冲洗色谱柱。
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