增强型BCA蛋白定量试剂盒

Enhanced Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination

BSA标准品为5 mg/ml BSA，溶于水中，含0.05%叠azide氮钠。

室温运输和储存。如因温度低或长时间放置出现沉淀，将其摇匀即可使用。BSA标准品保存在-20度，如出现微生物污染则应丢弃。

半岛bd体育手机客户端 简介

BCA蛋白定量的原理是基于蛋白质与铜离子和碱性染料（BCA）的化学反应。在碱性条件下，蛋白质中的蛋白质酰基（-NHCO-)与BCA中的Cu2+离子形成紫色络合物，其吸光度与蛋白质的浓度成正比。因此，通过测量样品中的紫色络合物的吸光度，可以计算出样品中蛋白质的浓度。

增强型BCA蛋白定量试剂盒采用了浓缩型试剂配方，提高了孵育时间和温度，因此可以增加样品体积和增加光吸收值，从而能够检测更低浓度的蛋白，检测范围可低至0.5到20 μg/ml。

标准蛋白和工作液的配制

配制牛血清白蛋白梯度：可根据检测范围和预估的蛋白浓度来配制BSA浓度梯度，建议使用与待测样品相同的溶剂。可按比例放大或缩小，根据实际需要计算所需用量。

BCA工作液的配制

根据需要测定的未知样品和蛋白标准品的数量以及复孔数来计算所需的BCA工作液体积。如使用试管进行测试，每管需1.0 mL工作液, 而使用96孔板进行测试则每孔需150 μl 工作液。

按 组份A:组份B:组份C = 25:24:1 的比例配制BCA工作液。组份C加入组份A+B的时候，开始会出现浑浊并随着混匀很快消失，最终混匀后溶液呈苹果绿色。配置好的工作液在室温密闭的条件下24小时内稳定。

操作步骤

如在试管中进行反应，取1.0 ml的BSA蛋白梯度或者待测样品，放入标记好的试管中，再每管加入1.0 ml 工作液，充分混匀， 盖上盖子，并在60°C 孵育60 minutes, 检测范围： 0.5-20 μg/ml。

延长孵育时间会增加光吸收值；应使用水浴法加热，以使得温度均衡上升；用鼓风法升温会导致温度不均衡，使实验误差增大。

如需在96孔板中进行反应，则每孔放入150 μl的BSA蛋白梯度或者待测样品，再加入150 μl工作液，充分混匀，37度孵育120分钟，检测范围为2-40 μg/ml；注意温度不要高于37度，否则会出现背景升高和反应异常，大多数聚苯乙烯（polystyrene）微孔板会在60度出现雾化现象；应使用水浴法加热。

将试管或96孔板冷却至室温。

用分光光度计或酶标仪在562 nm处读取光吸收值, 所有样品应在10分钟内读完。因为BCA反应没有终点，随着时间的推移光吸收值会继续上升，在10分钟内读完所有样品可以避免产生明显的误差。

将BSA蛋白标准品和待测样品的光吸收值减去空白对照值，以得到的蛋白标准品光吸收值对蛋白浓度作标准曲线，根据这个曲线方程计算待测样品的蛋白浓度。

注意事项：

测定蛋白浓度时，建议使未知样品的蛋白浓度处于标准拟合曲线的接近中间位置，这样获得的结果更准确。

通过增加孵育时间或者提高样品比例，可以提高光吸收值，从而检测更低的蛋白量，但是会缩小检测范围，可根据实际需要进行调整，同时注意不要超过半岛游戏平台官网入口网址 的检测上限。

最适检测波长为562 nm。在540 nm到590 nm区间也可进行检测, 但标准曲线斜率和检测灵敏度都会有所降低。

酶标仪的检测光径比分光光度计的比色杯短，因而检测灵敏度有所降低。

用软件对酶标仪的读数进行曲线拟合时，采用best-fit polynomial equation进行拟合可以获得比线性拟合更准确的结果；手工拟合时可采用线性拟合法。

EDTA浓度必须小于0.5 mM，不兼容EGTA。不适用BCA法时，请使用Bradford蛋白浓度测定法。

每种常用的总蛋白测定方法测定不同的蛋白时都有一些偏差。导致产生这些偏差的原因有：蛋白质的氨基酸序列，等电点，蛋白的结构，特定种类的氨基酸侧链和辅基。有些种类的氨基酸侧链和辅基能对显色反应产生很大的影响。大部分蛋白测定方法都使用牛血清白蛋白（BSA）或免疫球蛋白(IgG)作为标准品来制作标准曲线。如果需要特别精确的检测结果，可以使用待测蛋白的纯品来制作标准曲线。

一些物质可以干扰BCA反应，如还原剂、络合剂，以及强酸和强碱。还有一些物质干扰较小，只要不超过最大兼容浓度即不影响反应的进行。

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