WB难，一入 WB深似海，磷酸化蛋白的 WB检测更是难上加难！因为一旦细胞裂解，就会释放出蛋白酶和磷酸酶，可以降解或修饰蛋白质，从而影响检测结果。怎么搞定？

1、将样品置于冰上，使用预冷的缓冲液

样品处理中使用的设备或缓冲液应在冰上(4 ℃)冷藏保存。尽可能使用预冷的试剂和设备，可以减缓去磷酸化、蛋白水解和变性。

2、使用磷酸酶抑制剂

在裂解缓冲液中加入磷酸酶抑制剂，否则轻者条带不明显，重者没有条带。*好是添加新鲜配制的蛋白酶-磷酸酶抑制剂混和物。

3、将样品储存在上样缓冲液(loading buffer)中

蛋白定量后，将样品与上样缓冲液混合，遏制磷酸酶活性。随后可以将样本等分并储存在冰箱中或加载到凝胶上。

4、避免使用牛奶作为封闭剂

牛奶中含有大量的一种磷蛋白——酪蛋白，会引起高背景。建议使用牛血清白蛋白BSA或无蛋白的封闭剂。

5、使用无磷酸盐缓冲液

为尽量减少非特异性信号，用 TBST代替磷酸盐缓冲液(PBS)。如果在中间步骤中必须使用 PBS，则应在加入蛋白检测底物前，用大量 TBST清洗膜，以除去过量的磷酸钠。

6、使用灵敏的底物进行化学发光检测

如需检测一种弱磷酸化的低丰度蛋白，可使用抗体对蛋白进行免*疫沉淀获得浓缩的蛋白，并在泳道中上样更多的蛋白，同时使用高灵敏度的底物进行化学发光检测。

7、检测总蛋白含量

为确定 WB上信号的缺失是由于磷酸化效率低还是磷酸化蛋白分离不充分，同时需要检测总蛋白含量。例如，使用配对抗体检测磷酸化和未修饰的蛋白。

总之，磷酸化蛋白的 WB与非磷酸化蛋白基本相似，但在样品制备过程中必须谨慎操作，避免去磷酸化。