相差显微镜是荷兰科学家Zernike于1935年发明的，用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化(振幅差)，这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的区别是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。

    相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位指在某一时间上，光的波动所达到的位置。一般由于被检物体(如不染色的细胞)所能产生的相差太小，肉眼很难分辨，只有在变相差为振幅差(明暗差)之后才能被区分。相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差(即光程之差)。而相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。

    利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅(光强度)的差别，经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测的显微镜。主要用于观察活细胞或不染色的组织切片，有时也可用于观察缺少反差的染色样品。
    把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ(波长)，如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜4个特殊之处：
    1、环形光阑(annular diaphragm)位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。
    2、相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种：
    (1) A⁺相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差(或称负反差)。
    (2) B⁺相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差(或称正反差)，结构比周围介质更加变暗。
    3、合轴调节望远镜：用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合。

    相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。因此，是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。

    (1) 视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大，而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共轭面又吸收大部分光。
    (2) 不同型号的光学部件不能互换使用。
    (3) 载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准，不能过薄或过厚。
    (4) 切片不能太厚，一般以5—10μm为宜，否则会引起其他光学现象，影响成像质量。