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黄瓜绿斑驳花叶病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
黄瓜绿斑驳花叶病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒图片
包装: 50次


半岛bd体育手机客户端 名称
Cucumber Green Mottle Mosaic Virus(CGMMV) Probe qRT-PCR Kit
半岛bd体育手机客户端 介绍

半岛bd体育手机客户端 及特点

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber Green Mottle Mosaic Virus,CGMMV是由Ainsworth**记述,在欧洲、印度和日本葫芦科植物上发现的一种 RNA病毒,病毒易通过汁液传播,但病毒的寄主范围较窄,可通过树叶的接触,植物栽培中的操作,土壤及黄瓜种子传毒。CGMMV侵染植物产生的症状因寄主、环境条件及株系的不同而有差异,一般会使葫芦科作物的植株生长缓慢、矮化,结果延迟,严重的导致不孕;叶片出现色斑、水疱及变形;果实外部通常没有症状或出现色斑,内部果肉往往出现变色、纤维化及腐烂;有的病株不出现症状而表现为无症侵染。本半岛bd体育手机客户端 以探针法荧光定量 RT-PCR技术为基础开发的专门检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒,它具有下列特点:

1、即开即用,用户只需要提供样品 RNA模板。

2、引物和探针经过优化,灵敏度高,可达到 50拷贝/反应。

3、提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4、特异性高,引物是根据黄瓜绿斑驳花叶病毒高度保守区设计,不会跟其他病毒的 RNA发生交叉反应。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的探针法荧光定量 RT-PCR反应。

6、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分 编号 五孔盒包装
探针法 qRT-PCR缓冲液 190504a 500μL(蓝盖)
探针法 qRT-PCR酶混合液 190504b 100μL(红盖)
荧光 PCR专用模板稀释液 180701 1mL(黄盖)
黄瓜绿斑驳花叶病毒探针法qRT-PCR引物-探针混合液 15-2020ywpb 150μL(棕色管)
黄瓜绿斑驳花叶病毒探针法 qRT-PCR阳性对照(1×107拷贝/μL) pc2020-AF417242.1 50μL(黄盖)
使用手册 15-2020sc 1份

运输及保存

低温运输,-20℃保存,保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 RNA,超纯水。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10E1-106拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原,本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 5个离心管,分别为 6,5,4,3,2,1。

2、用带芯枪头分别加入 45μL荧光 PCR专用模板稀释液,**用带芯枪头,下同)。

3、在 6号管中加入 5μL1×107拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1分钟,得 1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头,在 5号管中加入 5μL1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1分钟,得 1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头,在 4号管中加入 5μL1×105拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1分钟,得 1×104拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA的制备

7、如果有 N个样品,**设置 N+2个提取,多出的一个是样品制备 PC(样品制备阳性对照),一个是样品制备 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为样品制备 PC。另外用水作为样品制备 NC。

8、用自选方法纯化样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。

三、设置 qRT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做 1次重复,则标记 N+9个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照(用水做模板),5个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1次重复,则标记 N+4个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照(用水做模板),1个用于 PCR阳性对照(用试剂盒提供的阳性对照的 10000倍稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):

成分 样品管N+2个 PCR阴性对照管 标准曲线样品管(1-6管)
探针法 qRT-PCR缓冲液 10μL 10μL 各 10μL
探针法 qRT-PCR酶混合液 2μL 2μL 各 2μL
黄瓜绿斑驳花叶病毒探针法qRT-PCR引物-探针混合液 3μL 3μL 各 3μL
N+2个待测 RNA模板 5μL 不加 不加
超纯水 不加 5μL 不加
第 6步所得标准曲线样品稀释液(1-6号) 不加 不加 各 5μL(1号样到 2号管,3号样到 3号管…)

11、盖上盖子后上机,按下面参数进行 RT-PCR:

过程 温度 时间
逆转录 50℃ 30min
预变性 95℃ 10min
PCR反应(40个循环) 95℃ 15sec
PCR反应(40个循环) 60℃ 40sec(采集 FAM通道的荧光信号)

四、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log值为横轴,以 Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log值,再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于 35。对待测样品,如果其 Ct大于或等于 40则为阴性,如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间,则重复一次。若重复结果 Ct值小于 35,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。

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