半岛bd体育手机客户端 及特点

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber Green Mottle Mosaic Virus，CGMMV是由Ainsworth**记述，在欧洲、印度和日本葫芦科植物上发现的一种 RNA病毒，病毒易通过汁液传播，但病毒的寄主范围较窄，可通过树叶的接触，植物栽培中的操作，土壤及黄瓜种子传毒。CGMMV侵染植物产生的症状因寄主、环境条件及株系的不同而有差异，一般会使葫芦科作物的植株生长缓慢、矮化，结果延迟，严重的导致不孕；叶片出现色斑、水疱及变形；果实外部通常没有症状或出现色斑，内部果肉往往出现变色、纤维化及腐烂；有的病株不出现症状而表现为无症侵染。本半岛bd体育手机客户端 以探针法荧光定量 RT-PCR技术为基础开发的专门检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品 RNA模板。

2、引物和探针经过优化，灵敏度高，可达到 50拷贝/反应。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据黄瓜绿斑驳花叶病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的 RNA发生交叉反应。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的探针法荧光定量 RT-PCR反应。

6、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分	编号	五孔盒包装
探针法 qRT-PCR缓冲液	190504a	500μL(蓝盖)
探针法 qRT-PCR酶混合液	190504b	100μL(红盖)
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1mL(黄盖)
黄瓜绿斑驳花叶病毒探针法qRT-PCR引物-探针混合液	15-2020ywpb	150μL(棕色管)
黄瓜绿斑驳花叶病毒探针法 qRT-PCR阳性对照(1×107拷贝/μL)	pc2020-AF417242.1	50μL(黄盖)
使用手册	15-2020sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 RNA，超纯水。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10E1-10⁶拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 5个离心管，分别为 6，5，4，3，2,1。

2、用带芯枪头分别加入 45μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在 6号管中加入 5μL1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 5号管中加入 5μL1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 4号管中加入 5μL1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA的制备

7、如果有 N个样品，**设置 N+2个提取，多出的一个是样品制备 PC(样品制备阳性对照)，一个是样品制备 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样品制备 PC。另外用水作为样品制备 NC。

8、用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。

三、设置 qRT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，5个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用试剂盒提供的阳性对照的 10000倍稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线样品管(1-6管)
探针法 qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各 10μL
探针法 qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	各 2μL
黄瓜绿斑驳花叶病毒探针法qRT-PCR引物-探针混合液	3μL	3μL	各 3μL
N+2个待测 RNA模板	5μL	不加	不加
超纯水	不加	5μL	不加
第 6步所得标准曲线样品稀释液(1-6号)	不加	不加	各 5μL(1号样到 2号管，3号样到 3号管…)

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 RT-PCR：

过程	温度	时间
逆转录	50℃	30min
预变性	95℃	10min
PCR反应(40个循环)	95℃	15sec
PCR反应(40个循环)	60℃	40sec(采集 FAM通道的荧光信号)

四、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 35。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。若重复结果 Ct值小于 35，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。