半岛bd体育手机客户端 及特点

隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)为体积微小的球虫类寄生虫,广泛存在多种脊椎动物体内，寄生于人和大多数哺乳动物的主要为微小隐孢子虫，由微小隐孢子虫引起的疾病称隐孢子虫病，是一种以腹泻为主要临床表现的人畜共患性原虫病,会给人体健康带来严重损害，因此快速检测隐孢子虫具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本半岛bd体育手机客户端 就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测隐孢子虫的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2、引物和探针经过优化，灵敏性高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据人隐孢子虫高度保守区设计，不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

6、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装
2×Probe qPCR MagicMix	190303	0.5 mL(本色盖)
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
隐孢子虫探针法qPCR引物混合液	15-26800yw	100μL(白盖)
隐孢子虫qPCR探针0.5μM	15-26800pro	100μL(棕色管)
隐孢子虫PCR阳性对照2.0(1×108拷贝/μL)	60908-29440pc	50 μL(红盖)
核酸释放剂试用装	61202	20次(1mL,绿盖)
使用手册	15-26800sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂

样品DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以10²-10⁷拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1、标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在7号管中加入5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7、如果有N个样品，**设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。

8、用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的细菌DNAout或柱式细菌DNAout。本试剂盒免费赠送20次免DNA提取的核酸释放剂，本半岛bd体育手机客户端 的裂解液可以直接作为PCR模板，省略了DNA提取步骤。

三、ProbeqPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管 N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线 样品管(2-7管)
2×ProbeqPCR MagicMix	10μL	10μL	各10μL
隐孢子虫qPCR探针	2 μL	2 μL	各2 μL
隐孢子虫探针法qPCR引物混合液	2 μL	2 μL	各2 μL
N+2个待测DNA模板	6 μL	不加	不加
超纯水	不加	6 μL	不加
第7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号)	不加	不加	各6μL(2号样到2号管，3号样到3号管…)

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

过程	温度	时间
预变性	94℃	5 min
PCR反应(40个循环)	94℃	0.5 min
	55℃	0.5 min(采集FAM通道的荧光信号)
	72℃	0.5 min
最后延伸	72℃	10 min

五、数据处理

12、以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

六、电泳检测

13、如果有必要电泳确认，可取10-20uL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为400bp。但电泳非常容易污染实验环境，建议不轻易采纳。