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西部马脑脊髓炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒
西部马脑脊髓炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒图片
包装: 50次
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半岛bd体育手机客户端 别名: Western Equine Encephalomyelitis Virus(WEEV) SYBR qRT-PCR Kit
半岛bd体育手机客户端 介绍

半岛bd体育手机客户端 及特点

西部马脑脊髓炎病毒(Western Equine Encephalomyelitis Virus,WEEV)是一种 RNA病毒,能引起病毒性急性传染病,人畜共患,是失能性病毒类生物战剂的一种,极少数人感染后表现为西尼罗河病毒性脑炎、脑膜脑炎和脑膜炎,因此快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本公司半岛bd体育手机客户端 开发西部马脑脊髓炎病毒染料法荧光定量 RT-PCR试剂盒,它具有下列特点:

1、一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。

2、根据西部马脑脊髓炎病毒的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。

3、基于染料法 qRT-PCR检测,灵敏度比常规 RT-PCR高 10-100倍,可以达到至少 1000拷贝/反应。

4、使用一管式 qRT-PCR技术,RT和 PCR两步在一个试管内完成,不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 30μL体系的 RT-PCR,只能用于科研,不能用于临床。

规格及成分

成份 编号 十孔盒包装
2×qRT-PCR缓冲液 190101a 500 μL(棕色管)
10×qRT-PCR酶混合液 190101b 100 μL(红盖)
ROX染料 I,50× 190101c 20 μL(棕色管)
ROX染料 II,50× 190101d 20 μL(棕色管)
荧光 PCR专用模板稀释液 180701 1mL(黄盖)
西部马脑脊髓炎病毒染料法qRT-PCR引物混合液 14-31900yw 100 μL(白盖)
西部马脑脊髓炎病毒染料法qRT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL) 60908-31900pc 50 μL(黄盖)
核酸释放剂(试用装) 61202 20次(1mL,绿盖)
使用手册 14-31900sc 1份

运输及保存

低温运输,-20℃保存,保存期限为 12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照,只提供 DNA片段作为阳性对照。

自备试剂

样品 RNA

使用方法

一、稀释阳性对照(以 102-107这 6个 10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原。

1、标记 6个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液,**用带芯枪头,下同)。

2、在 7号管中加入 5 μL 1×108拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供),充分震荡 1分钟,得 1×107拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

3、换枪头,在 6号管中加入 5 μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1分钟,得 1×106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

4、换枪头,在 5号管中加入 5 μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1分钟,得 1×105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 RNA的制备

5、如果有 N个样品,必须设置 N+2个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4号(浓度为 1×104拷贝/μL,10μL相当于 1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

6、用自选方法纯化 N+2个样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20次免 RNA提取的核酸释放剂试用装。

三、设置 RT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)

7、如果做定量分析并且只做 1次重复,则标记 N+9个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照,6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1次重复,则标记 N+4个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照(用水做模板),1个用于 PCR阳性对照(用第 4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把 6个标曲反应缩减成 1个,其余不变。

8、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加):

成分

N+2个制备所得样品 qRT-PCR阴性对照 qRT-PCR阳性对照(2-7管)
2×qRT-PCR缓冲液 10μL 10μL 各 10μL
西部马脑脊髓炎病毒染料法 qRT-PCR引物混合液 2μL 2μL 各 2μL
50×ROX (见注) 0.4μL 0.4μL 各 0.4μL
样品制备所得 RNA模板(来于第 8步) 5.6μL - -
稀释所得 6个阳性对照(来于第 6步) - - 各 5.6μL(2号样到 2号管,3号样到 3号管…)
超纯水 - 5.6μL -
10×qRT-PCR酶混合液 2μL 2μL 2μL

注:需使用 ROX染料 I的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。

需使用 ROX染料 II的机型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II) Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用 ROX的机型:Thermal Cycle Dice Real Time System ,LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P 、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9、上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因半岛游戏平台官网入口网址 不同而需优化)。

过程 温度 时间
RT(逆转录) 50℃ 15-30 min
预变性 95℃ 5 min
qRT - PCR反应(40个循环) 95℃ 15 sec
qRT - PCR反应(40个循环) 60℃ 1 min(采集 FAM通道的荧光信号)
按半岛游戏平台官网入口网址 预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理

10、如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log值为横轴,以 Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值,再推算出其浓度。

11、如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct大于或等于 40则为阴性,如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间,则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性,如果小于 40,则为阳性。

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