半岛bd体育手机客户端 及特点

牛羚关联恶性卡他热病毒(Wildebeest-associated Malignant Catarrhal Fever Virus，WA-MCF)会引起肉牛恶性卡他热病，自然感染的情况下，主要是牛容易发生该病，尤其是1～4岁的牛比较容易发生，而老龄牛和幼龄牛相对比较少发病。病牛往往突然出现高热，体温升高达到41-42℃，呈稽留热，且体质迅速虚弱，接着眼、口、鼻黏膜很快出现严重炎症。双眼不停流泪，眼脸发生肿胀闭合，且有纤维素性脓性分泌物流出，角膜发生混浊，甚至形成溃疡，最终导致失明。这一疾病对养牛业造成巨大危害，因此牛羚关联恶性卡他热病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，为此本公司开发了简单快捷的牛羚关联恶性卡他热病毒染料法荧光定量PCR检测试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供病毒样品。

2、根据牛羚关联恶性卡他热病毒保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。

3、灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4、一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染。

5、本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。

6、本半岛bd体育手机客户端 只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装
2×qPCR MagicMix	90408	500μL(棕色管)
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
牛羚关联恶性卡他热病毒PCR引物混合物	14-87400yw	100μL(白盖)
牛羚关联恶性卡他热病毒PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	14-87400pc	50μL(红盖)
DNA病毒裂解液(试用装)	3674a	15次(9 mL)
使用手册	14-87400sc	1份

运输及保存

低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

DNA模板、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。

使用方法

一、稀释PCR阳性对照(以10²-10⁷拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)

1、注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

2、标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

3、用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液(**用带芯枪头，下同)。

4、在7号管中加入5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5、换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7、重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

8、如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10⁵拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。

9、用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒DNAout或其升级版柱式病毒DNAout。本试剂盒免费赠送15次一管式病毒DNAout。

三、设置qPCR反应(20 μL体系，在样品制备室进行)

10、如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。

11、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管 N+2个	PCR阴性对照管	PCR阳性 对照管(2-7管)
2×qPCR MagicMix(棕色管)	10μL	10μL	各10μL
牛羚关联恶性卡他热病毒PCR引物混合液(白盖)	2 μL	2 μL	各2 μL
自备10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	各2 μL
N+2待测样品DNA模板	6 μL	不加	不加
第7步所得PCR阳性对照稀释液(2-7号)	不加	不加	各6μL(2号样到2号管，3号样到3号管…)

注:仅ABI7500、7700和7900半岛游戏平台官网入口网址 需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR半岛游戏平台官网入口网址 (如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX，则用水替代。

12、盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据半岛游戏平台官网入口网址 不同而自行优化)。

过程	温度	时间
预变性	92℃	5分钟
PCR反应(30个循环)	94℃	60秒
	54℃	60秒
	76℃	60秒

13、数据采集

具体操作按所用半岛游戏平台官网入口网址 推荐的流程进行。本半岛bd体育手机客户端 中所含的荧光染料在不结合DNA时，最大吸收光谱在471 nm，结合DNA时的最大吸收光谱在500 nm，最大发射光谱在530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

四、数据处理

14、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

15、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。