半岛bd体育手机客户端 及特点

地毯草黄单胞菌菜豆致病变种(Xanthomons axonopodis pv. phaseoli)，属细菌薄壁菌门黄单胞杆菌属 。异名野油菜黄单胞菌的菜豆致病变种 (x. campestris pv. phaseoli(E.F.Smith) Dye.).菌体短杆状，极生单根鞭毛，有荚膜，革兰氏染色阴性。病菌发育适温为 28～32℃，最适 pH7.3。病菌主要在种子上越冬，也可随病残体在士壤中越冬。种子内的病菌可存活 3～15年。通过风雨、昆虫、灌溉水、农事操作等传播(3)侵染:种子带菌使幼苗子叶及生长点发病，病部产生菌脓，气孔、水孔、伤口侵入，引起叶、荚、茎等部位发病。本半岛bd体育手机客户端 就是以探针法荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测地毯草黄单胞菌菜豆致病菌变种的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品 DNA模板。

2、引物和探针经过优化，灵敏性高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据地毯草黄单胞菌菜豆致病菌变种 DNA高度保守区设计，不会跟其他微生物的 DNA发生交叉反应。

5、既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5个数量级。

6、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的探针法荧光定量 PCR反应。

7、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分	编号	五孔盒包装
2×Probe qPCR MagicMix	190303	500 μL(红盖)
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(绿盖)
超纯水	100935	1 mL(白盖)
地毯草黄单胞菌菜豆致病菌变种探针法 qPCR引物-探针混合液	15-4890yp	150 μL(棕色管)
地毯草黄单胞菌菜豆致病菌变种探针法 qPCR阳性对照(1×107拷贝/μL)	4890pc	50 μL(黄盖)
使用手册	15-4890sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10E1-10⁶拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。

由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 6个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。

2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同。

3、在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 4号管中加入 5 μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

7、如果有 N个样品待提取，**设置 N+2个提取，多出的是 PC(样品制备阳性对照)和 NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的 1000倍稀释液10μL再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA提取试剂盒兼容。

三、Probe qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好

后最后加)：

成分/每管	样品管N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线样品管(1-6管)
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	10 μL
地毯草黄单胞菌菜豆致病菌变种探针法 qPCR引物-探针混合液	3 μL	3 μL	3 μL
N+2个待测 DNA模板	7 μL	-	-
超纯水	-	7 μL	-
第 6步所得标准曲线样品稀释液(1-6号)	-	-	7 μL(1号样到 1号管，2号样到 2号管…)

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	10 min
PCR反应(45个循环)	95℃	15 sec
PCR反应(45个循环)	60℃	60 sec(采集 FAM通道的荧光信号)

四、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品核酸浓度的 log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 39。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 39则为阳性。如果在 39-40之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性，如果小于 40，则为阳性。