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草莓黄单胞菌染料法荧光定量PCR试剂盒
草莓黄单胞菌染料法荧光定量PCR试剂盒图片
包装: 50次
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半岛bd体育手机客户端 别名: Xanthomonas-fragariae SYBR qPCR Kit
半岛bd体育手机客户端 介绍

半岛bd体育手机客户端 及特点

草莓角斑病是草莓生产上危害严重的细菌性病害 ,其病原菌是草莓角斑病菌(Xanthomonas fragariae),属于薄壁菌门(Gracilicutes)假单胞菌科(Pseudomonaceae)黄单胞菌属。草莓角斑病是草莓生产上危害极其严重的细菌病害。因此本试剂盒专门针对检测草莓黄单胞菌开发的 PCR试剂盒,具有以下特点:

1、即开即用,用户只需要提供 DNA模板。

2、引物根据草莓黄单胞菌设计,特异性高。

3、荧光定量 PCR检测,比常规 PCR更加灵敏,可达到 60拷贝/反应。

4、一管式闭管操作,降低了交叉污染。

5、本试剂盒足够 50次 20μL反应体系的荧光定量 PCR。

6、本半岛bd体育手机客户端 只适用于科研。

规格及成分

成分 编号 五孔盒包装
2×qPCR MagicMix 90408 500μL(棕色管)
荧光 PCR专用模板稀释液 180701 1mL(黄盖)
草莓黄单胞菌 PCR引物混合液 14-5140yw 100μL(白盖)
草莓黄单胞菌 PCR阳性对照(1×107拷贝/μL) pc5140-NZ-LT853882.1 50μL(黄盖)
使用手册 14-5140sc 1份

运输及保存

低温运输,-20℃保存,保存期限为 12个月。

自备试剂

DNA模板、超纯水、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 102-106拷贝/μL这 5个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。

1、标记 5个离心管,分别为 6,5,4,3,2。

2、用带芯枪头分别加入 45μL荧光 PCR专用模板稀释液,**用带芯枪头,下同)。

3、在 6号管中加入 5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1分钟,得1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头,在 5号管中加入 5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得 1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头,在 4号管中加入 5μL 1×105拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得 1×104拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 5个稀释度的标准曲线样品,放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

7、如果有 N个样品,**设置 N+2个提取,多出的一个是样品制备 PC(样品制备阳性对照),一个是样品制备 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为样品制备 PC。另外用水作为样品制备 NC。

8、用自选方法纯化 N+2个样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

三、设置 qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做 1次重复,则标记 N+9个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照(用水做模板),5个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1次重复,则标记 N+4个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照(用水做模板),1个用于 PCR阳性对照(用试剂盒提供的阳性对照的 10000倍稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):

成分 样品管N+2个 PCR阴性对照管 标准曲线样品管(1-6管)
2×qPCR MagicMix 10μL 10μL 各 10μL
草莓黄单胞菌 PCR引物混合液 2μL 2μL 各 2μL
N+2个待测 DNA模板 6μL 不加 不加
超纯水 不加 6μL 不加
第 6步所得标准曲线样品稀释液(2-6号) 不加 不加 各 6μL(2号样到 2号管,3号样到 3号管…)

11、盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:

过程 温度 时间
预变性 94℃ 5min
PCR反应(40个循环) 94℃ 1min
PCR反应(40个循环) 65℃ 1min(采集 SYBR通道的荧光信号)
PCR反应(40个循环) 72℃ 1min
按半岛游戏平台官网入口网址 预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log值为横轴,以 Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 cDNA浓度的 log值,再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct必须大于或等于 36。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于 33。对待测样品,如果其 Ct大于或等于 36则为阴性,如果小于或等于 33则为阳性。如果在 33-36之间,可结合熔解曲线判断,若样品的熔解温度与阳性对照相同,该样本判断为阳性,否则为阴性。结果如下图所示:

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