半岛bd体育手机客户端 介绍
半岛bd体育手机客户端 及特点 黄头病毒(Yellow Head Virus,YHV)是一种 RNA病毒,黄头病是对虾的主要病害之一,病毒感染的靶器官为虾的鳃、触角腺、造血组织、淋巴器官等。病虾发病初期摄食量增加,然后突然停止吃食,在 2-4天内会出现临床现象并死亡。许多濒临死亡的虾聚集在池塘角落的水面附近,其头胸甲因里面的干胰腺发黄而变成黄色,对虾体色发白,鳃棕色或白色,濒临死亡的虾其外胚层和中胚层发源的器官会出现全身性的坏死,已纳入世界卫生组织规定之检疫传染病之一,因此黄头病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本半岛bd体育手机客户端 基于 PCR原理开发。它具有下列特点: 1、一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。 2、根据黄头病毒的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。 3、基于染料法 qRT-PCR检测,灵敏度比常规 RT-PCR高 10-100倍,可以达到至少 1000拷贝/反应。 4、使用一管式 qRT-PCR技术,RT和 PCR两步在一个试管内完成,不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。 5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 30μL体系的 RT-PCR,只能用于科研,不能用于临床。 规格及成分
运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限为 12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照,只提供 RNA片段作为阳性对照。 自备试剂 样品 RNA 使用方法 一、稀释阳性对照(以 102-107这 6个 10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免 扩散传染性病原。 1、标记 6个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液,**用带芯枪头,下同)。 2、在 7号管中加入 5 μL 1×108拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供),充分震荡 1分钟,得 1×107拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。 3、换枪头,在 6号管中加入 5 μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1分钟,得 1×106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。 4、换枪头,在 5号管中加入 5 μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1分钟,得 1×105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。 二、样品 RNA的制备 5、如果有 N个样品,必须设置 N+2个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4号(浓度为 1×104拷贝/μL,10μL相当于 1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。 6、用自选方法纯化 N+2个样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20次免 RNA提取的核酸释放剂试用装。 三、设置 RT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行) 7、如果做定量分析并且只做 1次重复,则标记 N+9个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照,6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1次重复,则标记 N+4个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照(用水做模板),1个用于 PCR阳性对照(用第 4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把 6个标曲反应缩减成 1个,其余不变。 8、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加):
注:需使用 ROX染料 I的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、 Step-One、Step-One Plus。 需使用 ROX染料 II的机型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。 不需要使用 ROX的机型 : Thermal Cycle Dice Real Time System , LightCycler 、 Smart Cycler System 、 Agilent Mx3000P 、 RotorGene 3000、RotorGene 6000。 9、上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因半岛游戏平台官网入口网址 不同而需优化)。
四、数据处理 10.如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct必须大于或等于 37。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct大于或等于 37则为阴性,如果小于或等于 30则为阳性。如果在 30-37之间,则重复一次。 |
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