半岛bd体育手机客户端 及特点

扎伊尔埃博拉病毒(Zaire Ebola Virus,ZEBO)是一种RNA病毒，是一种能引起人类和其他灵长类动物产生埃博拉出血热的烈性传染病病毒，其引起的埃博拉出血热是当今世界上最致命的病毒性出血热，感染者症状与同为纤维病毒科的马尔堡病毒极为相似，包括恶心、呕吐、腹泻、肤色改变、全身酸痛、体内出血、体外出血、发烧等。死亡率在50%至90%之间，致死原因主要为中风、心肌梗塞、低血容量休克或多发性器官衰竭，因此快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本半岛bd体育手机客户端 基于PCR原理开发。它具有下列特点：

1、一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2、根据扎伊尔埃博拉病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3、基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。

4、使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分

成份	编号	十孔盒包装
2×qRT-PCR缓冲液	190101a	500 μL(棕色管)
10×qRT-PCR酶混合液	190101b	100 μL(红盖)
ROX染料I	190101c	50μL(棕色管)
ROX染料II	190101d	50μL(棕色管)
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1mL(亮黄盖)
扎伊尔埃博拉病毒RT-PCR引物混合液	14-30050yw	100μL(白盖)
扎伊尔埃博拉病毒RT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	14-30050pc	50μL(黄盖)
核酸释放剂试用装	61202	20次(1mL，绿盖)
使用手册	14-30050sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供RNA片段作为阳性对照。

自备试剂

样品RNA

使用方法

一、稀释阳性对照(以10²-10⁷这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原。

1、标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

2、在7号管中加入5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

3、换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

4、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

5、如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

6、用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20次免RNA提取的核酸释放剂试用装。

三、设置RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

7、如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。

8、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：

成分	N+2个制备所得样品	RT-PCR阴性对照	RT-PCR阳性 对照(2-7管)
2×qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各10μL
扎伊尔埃博拉病毒RT-PCR引物混合物	2μL	2μL	各2μL
50×ROX (见注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
样品制备所得RNA模板(来于第8步)	5.6μL	不加	不加
稀释所得6个阳性对照(来于第6步)	不加	不加	各5.6μL(2号样到2号管，3号样到3号管…)
10×qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL

注:需使用ROX染料I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。

需使用ROX染料II的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9、上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因半岛游戏平台官网入口网址 不同而需优化)。

过程	温度	时间
RT(逆转录)	50℃	15-30分钟
预变性	94℃	2分钟
RT - PCR反应(30个循环)	95℃	15秒
	60℃	15秒(采集FAM通道的荧光信号)
	72℃	15秒
按半岛游戏平台官网入口网址 预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理

10、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。

11、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。