半岛bd体育手机客户端 及特点

本试剂盒可用于检测食品或其他材料中是否有貂的成分。现代食品加工工艺极大改变了食材原有的味道、气味、色泽、纹理和质地等特性，因此传统的感官鉴别技术已经无法对食材的真伪进行准确的鉴定。同时部分食材还有致敏性，因此基于基因检测的快速灵敏的食材来源检测技术将对食品监管和安全提供重要的保障。本半岛bd体育手机客户端 就是为满足这一需求根据探针法 qPCR原理开发的半岛bd体育手机客户端 ，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品 DNA模板。

2、根据貂保守区域设计引物和探针，能专一性地检测出样品中的貂成分，但不能检测其他非貂成分。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、一管式闭管操作，降低了交叉污染。

5、快速，整个检测过程(按一个样品计)所需时间仅为 2.0小时。

6、对混合样品中貂成分的检测下限为 0.01%，对样品中貂成分的核酸检测下限为 0.1ng/μL。

7、本只能用于科研，足够 50次 20μL体系的荧光定量 PCR。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装
2×Probe qPCR MagicMix	190303	500μL(本色盖)
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
貂源性成分探针法 qPCR引物混合液	15-63300yw	100 μL(白盖)
貂源性成分 qPCR探针	15-63300pb	50 μL(棕色管)
貂源性成分探针法qPCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	60908-63300pc	50 μL(黄盖)
核酸释放剂试用装	61202	20次(1mL，绿盖)
使用手册	15-63300sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在 7号管中加入 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

7、如果有 N个样品，**设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数动物 DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式动物 DNAout。本试剂盒免费赠送 20次免 DNA提取的核酸释放剂，本半岛bd体育手机客户端 的裂解液可以直接作为 PCR模板，省略了 DNA提取步骤。

三、Probe qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线样品管(2-7管)
2×Probe qPCRMagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
貂源性成分 qPCR探针	1 μL	1 μL	各 1 μL
貂源性成分探针法 qPCR引物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2个待测 DNA模板	7 μL	-	-
超纯水	-	7 μL	-
第 7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号)	-	-	各 7 μL(2号样到2号管，3号样到 3号管…)

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	10 min
PCR反应(40个循环)	95℃	15 sec
PCR反应(40个循环)	60℃	1 min(采集 FAM通道的荧光信号)

五、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性，如果小于 40，则为阳性。