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产气荚膜梭状芽孢杆菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒
产气荚膜梭状芽孢杆菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒图片
包装: 50次
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半岛bd体育手机客户端 别名:Clostridium perfringens Probe qPCR Kit
半岛bd体育手机客户端 介绍

半岛bd体育手机客户端 及特点

产气荚膜芽孢杆菌又名魏氏梭菌,它广泛存在于自然环境中,并见于几乎所有温血动物的消化道内,属于人和动物肠道内正常菌群的成员。本菌能引起人类气性坏疽及多种动物的肠毒血症和坏死性肠炎,是近年来我国家畜“猝死症”的主要病原。因此对产气荚膜梭状芽孢杆菌进行快速灵敏的诊断具有重要的意义。荧光定量 PCR是检测传染性疾病的主流技术,本半岛bd体育手机客户端 是以荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测产气荚膜梭状芽孢杆菌的试剂盒,它具有下列特点:

1、即开即用,用户只需要提供样品DNA模板

2、引物和探针经过优化,灵敏性高。

3、提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4、特异性高,引物是根据产气荚膜芽孢杆菌高度保守区设计,不会扩增其它微生物病原成分。

5、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研,本试剂盒足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

规格及成分

成分

编号

十孔盒包装

2×Probe qPCR MagicMix

190303

500μL(本色盖)

荧光PCR专用模板稀释液

180701

1 mL(黄盖)

产气荚膜芽孢杆菌探针法qPCR引物混合液

15-34590yw

100μL(白盖)

产气荚膜芽孢杆菌qPCR探针

15-34590pb

50μL(棕色管)

产气荚膜芽孢杆菌探针法qPCR阳性对照(1×108拷贝/μL)

60908-34590pc

50 μL(黄盖)

使用手册

15-34590sc

1份

运输及保存

低温运输,-20℃保存,保存期限为12个月。

自备试剂

样品DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以102-107拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原,本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1、标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。

2、用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液,**用带芯枪头,下同)。

3、在7号管中加入5 μL 1×108拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×107拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头,在6号管中加入5 μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头,在5号管中加入5 μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7、如果有N个样品,**设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。

8、用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。

三、ProbeqPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):

成分

样品管

N+2

PCR阴性对照管

标准曲线

样品管(2-7管)

2×ProbeqPCR   MagicMix

10μL

10μL

各10μL

产气荚膜芽孢杆菌探针法qPCR探针

1 μL

1 μL

各1 μL

产气荚膜芽孢杆菌探针法qPCR引物混合液

2 μL

2 μL

各2 μL

N+2个待测DNA模板

7 μL

-

-

超纯水

-

7 μL

-

第7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号)

-

-

各7 μL(2号样到2号管,3号样到3号管…)

11、盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR:

过程

温度

时间

预变性

95℃

3 min

PCR反应(40个循环)

95℃

15sec

60℃

1 min(采集FAM通道的荧光信号)

四、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值,再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。若重复结果 Ct值小于40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。

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