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PCR/RT-PCR >> PCR试剂盒
艰难梭状芽孢杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒
艰难梭状芽孢杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒图片
包装: 50次
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半岛bd体育手机客户端 别名: Clostridium difficile Probe PCR Kit
半岛bd体育手机客户端 介绍

半岛bd体育手机客户端 及特点

艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)属厌氧性细菌,一般寄生在人的肠道内。如果过度服用某些抗生素,艰难梭菌的菌群生长速度加快,影响肠道中其他细菌,引发炎症。该细菌会引起伪膜性肠炎,临床表现为腹泻、腹痛、伴有全身中毒症状,症状突然开始,并伴随血压低,严重时能致死。通常还伴有发烧,白细胞增多,之后可导致死亡,是很严重的一类疾病。该细菌还会引起抗生素相关性腹泻,在体内的潜伏期为5-10天,之后导致大量的棕色或水状腹泻,持续1周左右。除上述疾病外,艰难梭菌尚可引起肾盂肾炎、脑膜炎、腹腔及阴道感染、菌血症和气性坏疽等。近年来该菌已成为医院内感染的病原菌之一,日益被人们所重视,因此快速检测艰难梭状芽孢杆菌具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术,本半岛bd体育手机客户端 就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测艰难梭状芽孢杆菌的试剂盒,它具有下列特点:

1、即开即用,用户只需要提供样品DNA模板。

2、引物和探针经过优化,灵敏性高。

3、提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4、特异性高,引物是根据人艰难梭状芽孢杆菌高度保守的VP1区设计,不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

6、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分

编号

十孔盒包装

2×Probe qPCR MagicMix

190303

0.5 mL(本色盖)

荧光PCR专用模板稀释液

180701

1 mL(黄盖)

艰难梭状芽孢杆菌PCR引物

15-34530yw

100μL(白盖)

艰难梭状芽孢杆菌qPCR探针

15-34530pro

100μL(棕色管)

艰难梭状芽孢杆菌阳性对照2.0(1×108拷贝/μL)

15-34530pc

50 μL(红盖)

DNA释放剂试用装

130982

50次(试用装)

使用手册

15-34530sc

1份

运输及保存

低温运输,-20℃保存,保存期限为12个月。

自备试剂

样品DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以102-107拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原,本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1、标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。

2、用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液,**用带芯枪头,下同)。

3、在7号管中加入5 μL 1×108拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×107拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头,在6号管中加入5 μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头,在5号管中加入5 μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7、如果有N个样品,**设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。

8、用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的细菌DNAout或柱式细菌DNAout。本试剂盒免费赠送50次免DNA提取的DNA释放剂,本半岛bd体育手机客户端 的裂解液可以直接作为PCR模板,省略了DNA提取步骤。

三、ProbeqPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)

9、如果只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于标准曲线样品。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):

成分

样品管

N+2

PCR阴性对照管

标准曲线

样品管(2-7管)

2×ProbeqPCR MagicMix(本色盖)

10μL

10μL

各10μL

艰难梭状芽孢杆菌 qPCR探针(绿盖)

2 μL

2 μL

各2 μL

艰难梭状芽孢杆菌 PCR引物混合液(白盖)

2 μL

2 μL

各2 μL

待测样品DNA模板

6 μL

不加

不加

第7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号)

不加

不加

各6μL(2号样到2号管,3号样到3号管…)

11、盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR:

过程

温度

时间

预变性

94℃

5 min

PCR反应(40个循环)

94℃

0.5 min

50℃

0.5 min(采集FAM通道的荧光信号)

72℃

0.5 min

最后延伸

72℃

10 min

五、数据处理

12、以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,再推算出其浓度。

六、电泳检测

13、如果有必要电泳确认,可取10-20μL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为400bp。但电泳非常容易污染实验环境,建议不轻易采纳。

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