半岛bd体育手机客户端 介绍
半岛bd体育手机客户端 及特点 肉毒梭状芽孢杆菌广泛存在于自然界,是一种专性厌氧的腐生菌,革兰阳性,菌体粗大,具有 4~8根周毛性鞭毛、运动迟缓,没有荚膜,芽孢卵圆形、近端位、芽孢比繁殖体宽。肉毒梭菌产生的肉毒毒素本质是蛋白质,为神经毒素,共产生六种毒素:A、B、C、D、E、F,其中的 A、B、E、F与人类的食物中毒有关。肉毒毒素毒性剧烈,少量毒素即可产生症状甚至致死,对人的致死量为 0.1μg。毒素摄入后经肠道吸收进入血液循环,输送到外围神经,毒素与神经有强的亲和力,阻止乙酰胆碱的释放,导致肌肉麻痹和神经功能不全。本半岛bd体育手机客户端 就是以探针法荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测肉毒梭状芽孢杆菌的试剂盒,它具有下列特点: 1、即开即用,用户只需要提供样品 DNA模板。 2、引物和探针经过优化,灵敏性高。 3、提供阳性对照,便于区分假阴性样品。 4、特异性高,引物是根据肉毒梭状芽孢杆菌高度保守区设计,不会跟其他病原DNA发生交叉反应。 5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的探针法荧光定量 PCR反应。 6、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。 规格及成分
运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限为 12个月。 自备试剂 样品 DNA。 使用方法 一、稀释标准曲线样品(以 102-107拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原,本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。 1、标记 6个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。 2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液,**用带芯枪头,下同)。 3、在 7号管中加入 5 μL 1×108拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1分钟,得 1×107拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 4、换枪头,在 6号管中加入 5 μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1分钟,得 1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 5、换枪头,在 5号管中加入 5 μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1分钟,得 1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。 二、样品 DNA的制备 7、如果有 N个样品,**设置 N+2个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。 8、用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA提取试剂盒兼容。 三、Probe qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行) 9、如果做定量分析并且只做 1次重复,则标记 N+9个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1次重复,则标记 N+4个 PCR管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品,1个用于 PCR阴性对照(用水做模板),1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。 10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
11、盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:
四、数据处理 12、如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log值为横轴,以 Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log值,再推算出其浓度。 13、如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct大于或等于 40则为阴性,如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间,则重复一次。若重复结果 Ct值小于 40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。 |
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