半岛bd体育手机客户端 及特点

本试剂盒可用于检测食品或其他材料中是否有火鸡的成分。现代食品加工工艺极大改变了食材原有的味道、气味、色泽、纹理和质地等特性，因此传统的感官鉴别技术已经无法对食材的真伪进行准确的鉴定。同时部分食材还有致敏性，因此基于基因检测的快速灵敏的食材来源检测技术将对食品监管和安全提供重要的保障。本半岛bd体育手机客户端 就是为满足这一需求根据PCR原理开发的半岛bd体育手机客户端 ，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品DNA。

2、根据火鸡保守区域设计引物，能专一性地检测出样品中的火鸡成分，但不能检测其他非火鸡成分。

3、荧光定量PCR检测，比常规PCR更加灵敏。

4、快速，整个检测过程(按一个样品计)所需时间仅为2.0小时。

5、一管式闭管操作，降低了交叉污染。

6、提供阳性标准品，便于分析实验结果。

7、对混合样品中火鸡成分的检测下限为0.1%，对样品中火鸡成分的核酸检测下限为 1.0ng/μL。

8、本只能用于科研，足够50次20uL体系的荧光定量PCR。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装(去纸托)
2×qPCR MagicMix	90408	0.5 mL(棕色)
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
火鸡源性成分PCR引物混合液	14-109yw	100 uL(白盖)
火鸡源性成分PCR阳性对照	14-109pc	50 uL(黄盖)
DNA释放剂试用装	130982	50次(成分见下)
免DNA提取试剂溶液A成分一	130982a	50 uL(白盖)
免DNA提取试剂溶液A成分二	130982	100uL(绿盖)
免DNA提取试剂溶液B	130982c	400 uL(红盖)
使用手册	13-510sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，有效期一年。使用本试剂盒提供的阳性对照时，由于其浓度较高，一定要注意不要污染其他试剂和成分。**在专门的区域操作。

自备试剂

DNA模板

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以10²-10⁷拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1、标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在7号管中加入5 μL阳性对照(浓度为1×10⁸拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7、用自选方法纯化样品的DNA，本半岛bd体育手机客户端 跟市场上绝大多数核酸纯化半岛bd体育手机客户端 兼容。

8、如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的DNA释放剂试用装。则按下面步骤操作：

9、配制溶液A工作液。以配制1mL工作液(足够10个样品)为例：在一干净塑料管中加入10uL溶液A成分一，20uL溶液A成分二和970uL超纯水，充分混合均匀即可。溶液A工作液可室温放置，但**在一周内用完，不要长期放置。一次检测一个样品需要100uL溶液A工作液，1mL工作液足够10个样品。如果待测样品数量为其他数字，配制的溶液A工作液的体积需要做相应的调整。

10、在标记好的N+2个离心管中，加入1-5mg固体样品(半粒芝麻大小)或5uL液体样品待测样品。在样品制备阳性对照中加入5uL阳性对照，在样品制备阴性对照中加入5uL水。

11、在每个管中加入100 uL溶液A工作液，确保固体样品被溶液淹埋，如果是液体样品则震荡混匀。

12、95℃保温10分钟。

13、待冷却到常温后加入10uL溶液B并混匀得DNA释放液。每个样品得到的DNA释放液足够进行50-100次PCR。

三、设置qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

14、如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品(也充当PCR阳性对照)。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。

15、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管 N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线 样品管(2-7管)
2×qPCR MagicMix (棕色管)	各10μL	10μL	各10μL
火鸡源型成分PCR引物混合液(白盖)	各2 μL	2 μL	各2 μL
自备10×ROX (见注)	各2 μL	2 μL	各2 μL
待测样品DNA模板	各6 μL	不加	不加
第7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号)	不加	不加	各6μL(2号样到2号管，3号样到3号管…)

注:仅ABI7500、7700和7900半岛游戏平台官网入口网址 需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR半岛游戏平台官网入口网址 (如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX，则用水替代。

16、盖上盖子后上机，按下面参数进行qPCR(具体PCR参数可以根据qPCR半岛游戏平台官网入口网址 的不同而自行优化)。

四、qPCR反应参数

过程	温度	时间
预变性	94℃	5 min
PCR反应 (35个循环)	94℃	0.5 min
	60℃	0.5 min(采集SYBR通道的荧光信号)
	72℃	0.5 min
最后延伸	72℃	10 min

五、数据处理

17、设定60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。

18、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

19、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

六、电泳检测

20、如果有必要电泳确认，可取10-20uL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为150bp。开盖电泳验证容易污染实验环境，强烈不建议采用此方法。