半岛bd体育手机客户端 及特点

基孔肯尼雅病毒(Chikungunya Virus，CHIKV)是一种 RNA病毒，会引起基孔肯雅病，发热病人常突然起病，寒战、发热，体温可达 39℃，伴有头痛、恶心、呕吐、食欲减退，淋巴结肿大。一般发热 1～7天即可退热，约 3天后再次，出现较轻微发热，持续 3～5天恢复正常，有些患者可有结膜充血和轻度结膜炎表现，关节疼痛与发热同时，患者全身的多个关节和脊椎出现十分剧烈的疼痛，且病情发展迅速，往往在数分钟或数小时内关节功能丧失，不能活动，因此灵敏快捷的诊断半岛bd体育手机客户端 具有重要的意义。本半岛bd体育手机客户端 以探针法荧光定量 RT-PCR技术为基础开发的专门检测基孔肯尼雅病毒的试剂盒，它具有下列特点：

1、一站式，用户不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2、根据基孔肯尼雅病毒基因组的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3、基于染料法 qRT-PCR检测，灵敏度比常规 RT-PCR高 10-100倍。

4、使用一管式 qRT-PCR技术，RT和 PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分

成份	编号	五孔盒包装
2×qRT-PCR缓冲液	190101a	500 μL(棕色管)
10×qRT-PCR酶混合液	190101b	100 μL(红盖)
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(绿盖)
基孔肯尼雅病毒染料法qRT-PCR引物混合液	14-15100yw	100 μL(白盖)
基孔肯尼雅病毒染料法qRT-PCR阳性对照(1×107拷贝/μL)	15100pc	50 μL(黄盖)
使用手册	14-15100sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供核酸片段作为阳性对照。

自备试剂

样品 RNA。

使用方法

一、稀释阳性对照(以 10E1-10⁶这 6个 10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原。

1、标记 6个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。

2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

4、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 4号管中加入 5 μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁴拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 RNA的制备

7、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4号(浓度为 1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于 10万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

8、用自选方法纯化 N+2个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。

三、设置 RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，1个用于 PCR阳性对照

(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6个标曲反应缩减成 1个，其余不变。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子关闭盖子后最后添加)：

成分/每管	N+2个制备所得样品	RT-PCR阴性对照	RT-PCR阳性对照(1-6管)
2×qRT-PCR缓冲液	10 μL	10 μL	10 μL
基孔肯尼雅病毒染料法qRT-PCR引物混合液	2 μL	2 μL	2 μL
样品制备所得RNA模板(来于第 6步)	6 μL	-	-
稀释所得 6个阳性对照(来于第 4步)	-	-	6 μL(1号样到1号管，2号样到2号管…)
10×qRT-PCR酶混合液	2 μL	2 μL	2 μL

注:个别qPCR半岛游戏平台官网入口网址 型号需要添加ROX染料校正，以消除管之间的光程差使其保持一致以使实验达到更准确的数据。

需使用 ROX染料 I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus，建议终浓度500nM。

需使用 ROX染料 II的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000，建议终浓度50nM。

9、上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因半岛游戏平台官网入口网址 不同而需优化)。

过程	温度	时间
RT(逆转录)	50℃	20 min
预变性	95℃	10 min
qPCR反应(40个循环)	95℃	30 sec
qPCR反应(40个循环)	57℃	30 sec
qPCR反应(40个循环)	72℃	30 sec(采集 SYBR通道的荧光信号)
按半岛游戏平台官网入口网址 预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

10、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

11、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于37。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于35。对待测样品，如果其Ct≥37则为阴性，如果≤35则为阳性。如果在35-37之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果≥37则为阴性，如果小于37，则为阳性 。熔解曲线也须一并考虑，如果熔解 Tm值与目的扩增片段 Tm值相差≥2℃，则为非特异性扩增，不是真正的阳性扩增。