半岛bd体育手机客户端 及特点

衣原体(chlamydia)是一种比细菌小但比病毒大的生物，是专性细胞内寄生的、近似细菌与病毒的病原体，具有两相生活环。它没有合成高能化合物ATP、GTP的能力，必须由宿主细胞提供，因而成为能量寄生物，多呈球状、堆状，有细胞壁，有细胞膜，属原核细胞，一般寄生在动物细胞内。其中的肺炎衣原体被认为是肺炎、支气管炎及其他呼吸道感染的常见病因；鹦鹉热衣原体可引起鹦鹉热，是人类吸入受感染的鸟的排泄物的干燥尘粒而感染，发病时常有高烧、头痛、肌肉痛、寒战和上下呼吸道不适，部分患者可并发脑炎、心肌炎或血栓性静脉炎。沙眼衣原体除可导致沙眼外，还是公认的性传播疾病的传染源之一。在非淋菌性尿道炎中，几乎一半是由沙眼衣原体传染造成的。它还可以引起尿道综合征和性病性淋巴肉芽肿、男性尿道炎、附睾炎、女性不育、子宫颈发炎、盆腔发炎等。新生儿通过产道感染可引起新生儿眼炎或新生儿肺炎。因此快速检测衣原体具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本半岛bd体育手机客户端 就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测衣原体的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2、引物和探针经过优化，分析灵敏性高在100拷贝左右/反应。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据衣原体DNA的高度保守区设计，insilico分析发现其不会跟其他非衣原体的DNA发生交叉反应。

5、可以检测至少6种常见的支原体：Chlamydiaabortus，Chlamydiapecorum，Chlamydiapneumonia，Chlamydiapsittaci，Chlamydiasuis，Chlamydiatrachomatis。

6、本半岛bd体育手机客户端 既可以定量，也可以定性。定量时其线性范围至少有5个数量级。

7、本半岛bd体育手机客户端 足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

8、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分	编号	五孔盒包装
2×Probe qPCR MagicMix	190303	0.5 mL(本色盖)
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
超纯水	100935	1 mL(亮黄盖)
衣原体通用探针法qPCR引物-探针混合液	yp15-11300	150μL(白盖)
衣原体通用PCR阳性对照(1×107拷贝/μL)	pc11300-D89067.1	50 μL(红盖)
使用手册	15-11300sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂

样品DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以10E1-10⁶拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1、标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。

2、用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在6号管中加入5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7、如果有N个样品，**设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL第4号稀释液(第6步所得)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样本制备PC。另外用水作为样本制备NC。

8、用自选方法纯化样品的DNA，本扩增试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。也可以使用本公司的核酸提取试剂盒。

三、ProbeqPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(可直接用第6步所得的第4号稀释液)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管 N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线样品管 (1-6管)
2×ProbeqPCRMagicMix	10μL	10μL	各10μL
衣原体通用探针法qPCR引物-探针混合液	3 μL	3 μL	各3 μL
N+2个待测DNA模板	7 μL	不加	不加
超纯水	不加	7 μL	不加
第6步所得标准曲线样品稀释液(1-6号)	不加	不加	各7μL(1号样到1号管，2号样到2号管…)

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	3 min
PCR反应(50个循环)	95℃	15sec
	67℃	15sec(采集FAM通道的荧光信号)
	72℃	15sec

五、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于45。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于40。对待测样品，如果其Ct大于或等于45则为阴性，如果小于或等于40则为阳性。如果在40-45之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于45则为阴性，如果小于45，则为阳性。