半岛bd体育手机客户端 及特点

布鲁氏杆菌(Brucellaspp.)是一种细胞内寄生小球杆状菌，革兰氏染色阴性，主要感染动物，牛、羊、猪、狗以及骆驼、鹿等动物，主要是通过接触感染的动物或者吃被感染的食物以及实验室接触等方式传播给人类。能引起人和多种动物的急性和慢急性疾病，被感染的人和动物表现为流产及不孕不育等症状，因此布鲁氏杆菌属通用的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，为此本公司开发了简单快捷的布鲁氏杆菌属通用染料法荧光定量 PCR检测试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供细菌样品。

2、根据布鲁氏杆菌属共同的保守序列设计的专一性引物，能检测常见的羊、牛、猪、犬布鲁氏杆菌，与其他细菌无交叉反应。

3、灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4、一管式荧光定量 PCR检测，避免后续污染。

5、本试剂盒足够 50次 20μL反应体系的荧光定量 PCR。

6、本半岛bd体育手机客户端 只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装
2×qPCR MagicMix	90408	500 μL(棕色管)
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
布鲁氏杆菌属通用染料法 qPCR引物混合液	14-61200yw	100μL(白盖)
布鲁氏杆菌属通用染料法 qPCR阳性对照 (1×108拷贝/μL)	14-61200pc	50μL(黄盖)
核酸释放剂	61202	20次(1 mL，绿盖)
使用手册	14-61200sc	1份

运输及保存

低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

DNA模板、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。

使用方法

一、稀释 PCR阳性对照(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)

1、注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA片段作为阳性对照。

2、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液(**用带芯枪头，下同)。

4、在 7号管中加入 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照，充分震荡 1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照到 5号管中，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

8、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL上步制备的 PCR阳性对照的第 4号(浓度为 1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于 1万拷贝)或第 5号(浓度为 1×10⁵拷贝/μL，10μL相当于 10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL起始病毒样品，则 PC和 NC的起始体积也必须是 200μL。

9、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数细菌 DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式细菌 DNAout。本试剂盒免费赠送 20次核酸释放剂试用装。

三、设置 qPCR反应(20 μL体系，在样品制备室进行)

10、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

11、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管N+2个	PCR阴性对照管	PCR阳性对照管(2-7管)
2×qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
布鲁氏杆菌属通用 qPCR引物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
自备 10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2待测样品 DNA模板	6 μL	-	-
超纯水	-	6 μL	-
第 7步所得 PCR阳性对照稀释液(2-7号)	-	-	各 6μL(2号样到2号管，3号样到 3号管…)

注:仅 ABI7500、7700和 7900半岛游戏平台官网入口网址 需要使用 ROX作为对照，其他荧光 PCR半岛游戏平台官网入口网址 (如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和 LightCycler480)不需要使用 ROX，则用水替代。

12、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR(具体 PCR参数可以根据半岛游戏平台官网入口网址 不同而自行优化)。

过程	温度	时间
预变性	95℃	10 min
PCR反应(40个循环)	95℃	15 sec
PCR反应(40个循环)	60℃	1 min(采集 FAM通道的荧光信号)
按半岛游戏平台官网入口网址 预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

13、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

14、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性，如果小于 40，则为阳性。