半岛bd体育手机客户端 及特点

牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus ,BVDV)是引起牛、羊和猪的一种接触性传染病。牛、羊以消化道黏膜糜烂、坏死，胃肠炎和腹泻为特征；猪则表现为怀孕母猪的不孕、产仔数下降和流产，以及仔猪的生长迟缓和先天性震颤等。牛以发热、白细胞减少、口腔及消化道粘膜糜烂、坏死和腹泻为特征，但大多数牛是隐性感染。本病呈世界分布，我国从美国、丹麦、西德、新西兰等十多个国家引进种牛，分离鉴定出了病毒。我国已在很多省内流行该病。该病毒具有较大的变异性，根据病毒基因组结构特点分为 2个基因型，即 BVDV-1和BVDV-2。因此牛病毒性腹泻病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本半岛bd体育手机客户端 以探针法荧光定量 RT-PCR技术为基础开发的专门检测牛病毒性腹泻病毒1型的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。

2、引物和探针经过优化，分析灵敏性高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据乙型肝炎病毒前基因组RNA高度保守区设计，不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。

5、既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。

6、本半岛bd体育手机客户端 足够50次20μL体系的探针法荧光定量RT-PCR反应。

7、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分	编号	五孔盒包装
探针法qRT-PCR缓冲液	190504a	500 μL(白盖)
探针法qRT-PCR酶混合液	190504b	100 μL(红盖)
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(绿盖)
牛病毒性腹泻病毒1型探针法qRT-PCR引物-探针混合液	15-59810yp	150μL(棕色管)
牛病毒性腹泻病毒1型探针法qRT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	59810pc	50 μL(黄盖)
使用手册	15-59810sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂

样品RNA，超纯水。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以10²-10⁷拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1、标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入45 μL荧光RT-PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同。

3、在7号管中加入5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

7、如果有N个样品，**设置N+2个提取，多出的是PC(样品制备阳性对照)和NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的10000倍稀释液10μL再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为PC。另外用水作为NC。

8、用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒RNAout或免提取核酸释放剂。

三、ProbeqRT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于RT-PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分/每管	样品管N+2个	RT-PCR阴性对照	标准曲线样品管(2-7管)
探针法qRT-PCR缓冲液	10 μL	10 μL	10 μL
探针法qRT-PCR酶混合液	2 μL	2 μL	2 μL
牛病毒性腹泻病毒1型探针法qRT-PCR引物-探针混合液	3 μL	3 μL	3 μL
N+2个待测RNA样本	5 μL	不加	不加
自备超纯水	不加	5 μL	不加
第6步所得标准曲线样品稀释液(2-7号)	不加	不加	5μL(2号样到2号管，3号样到3号管…)

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：

过程	温度	时间
逆转录	50℃	20 min
预变性	94℃	5 min
RT-PCR反应(45个循环)	94℃	20 sec
	62℃	20 sec(采集FAM通道的荧光信号)
	72℃	40 sec

五、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于38。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于38则为阳性。如果在38-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。