半岛bd体育手机客户端 及特点

线粒体是真核生物产生能量的重要细胞器，它具有自身的基因组，线粒体 DNA和细胞核 DNA共同决定真核生物的表现型，因此研究线粒体 DNA和对其精准定量具有重要的意义。本试剂盒基于荧光定量 PCR原理开发，可用于定量分析小鼠线粒体 DNA。它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品 DNA，整个检测过程(按一个样品计)所需时间仅为 2.0小时。

2、根据小鼠线粒体 DNA保守区域设计引物，能专一性地扩增小鼠线粒体 DNA，而与检测无关 DNA不会发生交叉反应。

3、基于染料法荧光定量 PCR原理，比常规 PCR更加灵敏。

4、一管式闭管操作，降低了交叉污染。

5、提供阳性标准品，便于分析实验结果。

6、本只能用于科研，足够 50次 20μL体系的荧光定量 PCR。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装
2×qPCR MagicMix	90408	0.5 mL(棕色)
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
小鼠线粒体 DNA染料法 qPCR引物混合液	14-141yw	100 μL(白盖)
小鼠线粒体 DNA染料法 qPCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	14-141pc	50 μL(黄盖)
核酸释放剂试用装	61202	20次(1mL，绿盖)
使用手册	13-141sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，有效期一年。使用本试剂盒提供的阳性对照时，由于其浓度较高，一定要注意不要污染其他试剂和成分。**在专门的区域操作。

自备试剂

DNA模板

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在 7号管中加入 5 μL阳性对照(浓度为 1×10⁸拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

7、用自选方法纯化样品的 DNA，本半岛bd体育手机客户端 跟市场上绝大多数核酸纯化半岛bd体育手机客户端 兼容。

8、如果有 N个样品，则需要进行 N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的核酸释放剂试用装。

三、设置 qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线样品管(2-7管)
2×qPCR MagicMix	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
小鼠线粒体 DNA染料法qPCR引物混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
自备 10×ROX (见注)	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2个待测 DNA模板	各 6 μL	不加	不加
超纯水	不加	6 μL	不加
第 7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号)	不加	不加	各 6μL(2号样到2号管，3号样到 3号管…)

注:仅 ABI7500、7700和 7900半岛游戏平台官网入口网址 需要使用 ROX作为对照，其他荧光 PCR半岛游戏平台官网入口网址 (如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和 LightCycler480)不需要使用 ROX，则用水替代。

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 qPCR(具体 PCR参数可以根据 qPCR半岛游戏平台官网入口网址 的不同而自行优化)。

四、qPCR反应参数

过程	温度	时间
预变性	94℃	5 min
PCR反应(40个循环)	94℃	0.5 min
PCR反应(40个循环)	50℃	0.5 min(采集 SYBR通道的荧光信号)
PCR反应(40个循环)	72℃	0.5 min
最后延伸	72℃	10 min

五、数据处理

12、设定 60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。

13、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

14、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性，如果小于 40，则为阳性。