半岛bd体育手机客户端 及特点

利什曼原虫是一种胞内寄生原虫，由媒介昆虫白蛉传播。寄生人体的利什曼原虫主要有杜氏利什曼原虫、硕大利什曼原虫、墨西哥利什曼原虫、巴西利什曼原虫等，其中，杜氏利什曼原虫引起的黑热病症状最重，致死率极高。本公司开发了杜氏利什曼虫基因染料法荧光定量 PCR试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供 DNA模板。

2、引物根据杜氏利什曼虫专一区设计，特异性高。

3、荧光定量 PCR检测，比常规 PCR更加灵敏。

4、一管式闭管操作，降低了交叉污染。

5、本试剂盒足够 50次 20μL反应体系的荧光定量 PCR。

6、本半岛bd体育手机客户端 只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分

运输及保存

低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

DNA模板、超纯水、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。

使用方法

一、稀释 PCR阳性对照(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)

1、注意：由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。

2、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3、用带芯枪头分别加入 45  μL荧光 PCR专用模板稀释液(**用带芯枪头，下同)。

4、在 7号管中加入 5  μL  1×10⁸拷贝/μL的阳性对照，充分震荡 1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5、换枪头，在 6号管中加入 5  μL  1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6、换枪头，在 5号管中加入 5  μL  1×10⁶拷贝/μL的阳性对照到 5号管中，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

8、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL PCR阳性对照的 10000倍稀释的(稀释后浓度为 1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于 10万拷贝，可以将 10μL原液加入到 990μL自备 TE溶液中，充分混匀，此为 100倍稀释液。再取 10μL此稀释液加入到 990μL自备 TE溶液中，充分混匀，此为 10000倍稀释液)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 DNA。

9、用自选方法纯化 N+2个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

三、设置 qPCR反应(20  μL体系，在样品制备室进行)

10、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号阳性对照稀释液，浓度为 10⁴拷贝/μL)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6个标曲反应缩减成 1个，其余不变。

11、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

注:仅 ABI7500、7700和 7900半岛游戏平台官网入口网址 需要使用 ROX作为对照，其他荧光 PCR半岛游戏平台官网入口网址 (如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和 LightCycler480)不需要使用 ROX，则用水替代。

12、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR(具体 PCR参数可以根据半岛游戏平台官网入口网址 不同而自行优化)。

四、数据处理

13、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 cDNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

14、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 32。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于27。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 32则为阴性，如果小于或等于 27则为阳性。如果在 27-32之间，可结合熔解曲线判断，若样品的熔解温度与阳性对照相同，该样本判断为阳性，否则为阴性。