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拉沙热病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒
拉沙热病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒图片
包装: 50次
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半岛bd体育手机客户端 别名: Lassa Fever Virus(LASV) SYBR qRT-PCR Kit
半岛bd体育手机客户端 介绍

半岛bd体育手机客户端 及特点

拉沙热病毒(Lassa Fever Virus,LASV)是一种RNA病毒,会引发拉沙病毒性出血热是发生在西非的一种病程1-4周的急性疾病。早期症状颇似流感,有寒战、发热、咽痛、恶心、呕吐、咳嗽、肌痛、吞咽困难、腹泻和胸腹痛等症状,少数病人有耳聋、眩晕、耳鸣等。体征有相对缓脉,结膜充血,颜面、颈、胸充血伴有肿胀,淋巴结肿大,肺部有罗音,腰部及肝区压痛明显。重症病人可见渗出性扁桃体发炎和口腔溃疡,有时有白喉样伪膜附着。部分病人有斑丘皮疹或出血样皮疹。严重病人有内脏出血、低血容量性休克和急性肾功能衰竭等。有时有神经系统症状,如眼球震颤、谵妄、昏倒、惊厥等,给人体健康带来较大的风险,因此拉沙热病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本半岛bd体育手机客户端 基于PCR原理开发。它具有下列特点:

1、一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。

2、根据拉沙热病毒的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。

3、基于染料法qRT-PCR检测,灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍,可以达到至少1000拷贝/反应。

4、使用一管式qRT-PCR技术,RT和PCR两步在一个试管内完成,不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够50次30μL体系的RT-PCR,只能用于科研,不能用于临床。

规格及成分

成份

编号

十孔盒包装

2×qRT-PCR缓冲液

190101a

500 μL(棕色管)

10×qRT-PCR酶混合液

190101b

100 μL(红盖)

ROX染料I

190101c

50μL(棕色管)

ROX染料II

190101d

50μL(棕色管)

荧光PCR专用模板稀释液

180701

1mL(亮黄盖)

拉沙热病毒RT-PCR引物混合液

14-75300yw

100μL(白盖)

拉沙热病毒RT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)

14-75300pc

50μL(黄盖)

核酸释放剂试用装

61202

20次(1mL,绿盖)

使用手册

14-75300sc

1份

运输及保存

低温运输,-20℃保存,保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照,只提供RNA片段作为阳性对照。

自备试剂

样品RNA

使用方法

一、稀释阳性对照(以102-107这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原。

1、标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液,**用带芯枪头,下同)。

2、在7号管中加入5 μL 1×108拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×107拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

3、换枪头,在6号管中加入5 μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

4、换枪头,在5号管中加入5 μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

5、如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×104拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

6、用自选方法纯化N+2个样品的RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20次免RNA提取的核酸释放剂试用装。

三、设置RT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)

7、如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个,其余不变。

8、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加):

成分

N+2个制备所得样品

RT-PCR阴性对照

RT-PCR阳性

对照(2-7管)

2×qRT-PCR缓冲液

10μL

10μL

各10μL

口蹄疫病毒RT-PCR

引物混合物

2μL

2μL

各2μL

50×ROX (见注)

0.4μL

0.4μL

各0.4μL

样品制备所得RNA模板(来于第8步)

5.6μL

不加

不加

稀释所得6个阳性对照(来于第6步)

不加

不加

各5.6μL(2号样到2号管,3号样到3号管…)

10×qRT-PCR

酶混合液

2μL

2μL

2μL

注:需使用ROX染料I的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。

需使用ROX染料II的机型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX的机型:Thermal Cycle Dice Real Time System, LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9、上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因半岛游戏平台官网入口网址 不同而需优化)。

过程

温度

时间

RT(逆转录)

50℃

15-30分钟

预变性

94℃

2分钟

RT - PCR反应(30个循环)

95℃

15秒

60℃

15秒(采集FAM通道的荧光信号)

72℃

15秒

按半岛游戏平台官网入口网址 预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理

10、如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值,再推算出其浓度。

11、如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。

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