半岛bd体育手机客户端 及特点

牛流行热病毒(Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV)会引起牛流行热，是一种急性热性传染病。其特征为突然高热，呼吸促迫，流泪和消化器官的严重卡他炎症和运动障碍。感染该病的大部分病牛经 2-3日即恢复正常，故又称三日热或暂时热。该病病势迅猛，但多为良性经过。过去曾将该病误认为是流行性感冒。该病能引起牛大群发病，明显降低乳牛的产乳量。该病毒会给养殖业带来较大的经济损失，因此牛流行热病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本半岛bd体育手机客户端 基于 PCR原理开发。它具有下列特点：

1、一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2、根据牛流行热病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3、基于染料法 qRT-PCR检测，灵敏度比常规 RT-PCR高 10-100倍，可以达到至少 1000拷贝/反应。

4、使用一管式 qRT-PCR技术，RT和 PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分

成份	编号	十孔盒包装
2×qRT-PCR缓冲液	190101a	500 μL(棕色管)
10×qRT-PCR酶混合液	190101b	100 μL(红盖)
ROX染料 I，50×	190101c	20 μL(棕色管)
ROX染料 II，50×	190101d	20 μL(棕色管)
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1mL(黄盖)
牛流行热病毒染料法 qRT-PCR引物混合液	14-24100yw	100 μL(白盖)
牛流行热病毒染料法 qRT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	60908-24100pc	50 μL(黄盖)
核酸释放剂(试用装)	61202	20次(1mL，绿盖)
使用手册	14-24100sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供 RNA片段作为阳性对照。

自备试剂

样品 RNA

使用方法

一、稀释阳性对照(以 10²-10⁷这 6个 10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原。

1、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

2、在 7号管中加入 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

3、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

4、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 RNA的制备

5、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4号(浓度为 1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于 1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

6、用自选方法纯化 N+2个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20次免 RNA提取的核酸释放剂试用装。

三、设置 RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

7、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6个标曲反应缩减成 1个，其余不变。

8、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：

成分	N+2个制备所得样品	RT-PCR阴性对照	RT-PCR阳性对照(2-7管)
2×qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各 10μL
牛流行热病毒染料法qRT-PCR引物混合液	2μL	2μL	各 2μL
50×ROX (见注)	0.4μL	0.4μL	各 0.4μL
样品制备所得 RNA模板(来于第 8步)	5.6μL	-	-
自备超纯水	-	5.6 μL	-
稀释所得 6个阳性对照(来于第 6步)	-	-	各 5.6μL(2号样到 2号管，3号样到 3号管…)
10×qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL

注:需使用 ROX染料 I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、 Step-One、Step-One Plus。

需使用 ROX染料 II的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用 ROX的机型 ： Thermal Cycle Dice Real Time System ， LightCycler 、 Smart Cycler System 、 Agilent Mx3000P 、 RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9、上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因半岛游戏平台官网入口网址 不同而需优化)。

过程	温度	时间
RT(逆转录)	50℃	15-30 min
预变性	95℃	10 min
RT-PCR反应(40个循环)	95℃	15 sec
RT-PCR反应(40个循环)	60℃	1 min(采集 SYBR通道的荧光信号)
按半岛游戏平台官网入口网址 预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

10、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 35则为阴性，如果小于或等于 30则为阳性。如果在 30-35之间，则重复一次。