半岛bd体育手机客户端 及特点

蓝舌病病毒(Bluetongue Virus，BTV)会引起蓝舌病，是反刍动物的一种严重传染病。以口腔、鼻腔和胃肠道黏膜发生溃疡性炎症变化为特征，病羊乳房和蹄部也常出现病变，且常因蹄真皮层遭受侵害而发生跛行，该病毒主要侵害绵羊，对养羊业造成严重损害，因此灵敏快捷的诊断半岛bd体育手机客户端 具有重要的意义。为此本公司基于 RT-PCR原理开发了本半岛bd体育手机客户端 ，可用于在科研领域快速定量检测蓝舌病病毒。它具有下列特点：

1、一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2、根据蓝舌病病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3、灵敏度可以达到 1000拷贝/反应。

4、使用一管式 RT-PCR技术，RT和 PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的 RT-PCR。

6、本半岛bd体育手机客户端 参考国标 GB/T18636-2017开发，只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分

成份	编号	十孔盒包装
5×双酶一管式 RT-PCR Buffer	91202a	200 μL(橙色盖)
MMLV-Taq Mix	91202b	75 μL(红盖)
超纯水	100935	1 mL(蓝色盖)
蓝舌病病毒通用 RT-PCR引物混合液	13-18200yw	100 μL(白盖)
蓝舌病病毒通用 RT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	13-18200pc	50 μL(黄盖)
核酸释放剂试用装	61202a	20次(1mL，绿盖)
使用手册	13-18200sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。收到货后阳性对照需要跟其他成分分开放置，因为其容易污染其他成分，造成假阳性。

自备试剂

样品 RNA

使用方法

一、样品 RNA的制备

1、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL蓝舌病病毒 PCR阳性对照的 10000倍稀释的(稀释后浓度为 1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝，可以将 10μL原液加入到 990μL自备 TE溶液中，充分混匀，此为 100倍稀释液。再取 10μL此稀释液加入到 990μL自备 TE溶液中，充分

混匀，此为 10000倍稀释液)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 RNA。

2、用自选方法纯化 N+2个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20次核酸释放剂试用装。

二、设置 RT-PCR反应(20μL体系)

3、如果有 N+2个样品，则标记 N+4个 PCR管(额外增加的两个管一个是 RT-PCR阳性对照，另一个是 RT-PCR阴性对照)并按照下表在 PCR管中加入下列成分：

成份	N+2个样品管	RT-PCR阴性对照	RT-PCR阳性对照
5×双酶一管式 RT-PCR Buffer	各 4 μL	4 μL	4 μL
蓝舌病病毒通用 RT-PCR引物混合液	各 2 μL	2 μL	2 μL
N+2个制备的 RNA样品	各 12.5 μL	不加	不加
超纯水	不加	12.5 μL	不加
蓝舌病病毒通用 RT-PCR阳性对照的 10000倍稀释液	不加	不加	12.5 μL
MMLV-Taq Mix	1.5 μL	1.5 μL	1.5 μL

4、上机进行 RT-PCR，RT-PCR反应参数为:

过程	温度	时间
逆转录	42℃	60分钟
预变性	95℃	5分钟
PCR反应(35个循环)	95℃	30秒
PCR反应(35个循环)	58℃	30秒
PCR反应(35个循环)	72℃	30秒
延伸	72℃	5分钟

5、琼脂糖电泳检测扩增效果，阳性样品预期得到的扩增产物长度为 273bp。如果阴性对照有此扩增产物或阳性对照无此扩增产物，则说明实验失败，需要分析实验失败的原因。只有在阴性对照没有此扩增产物、阳性对照有此扩增产物的情况下，才有必要分析样品的实验结果，如果有此扩增产物则为阳性，如果无则为阴性。