半岛bd体育手机客户端 及特点

禽致病性大肠杆菌 O1血清型(Avian Pathogenicity Escherichia coli， APEC)会引发大肠杆菌败血症，尤其在冬季发病率高，死淘率通常在 5%-20%，严重的可达 50%，雏鸡在夏季也较多发，病鸡精神不振，采食减少，衰弱和死亡，病鸡腹部膨满，排出黄绿色的稀便，特征性的病变是纤维素性心包炎，气囊混浊肥厚，有干酪样渗出物，肝包膜呈白色混浊，有纤维素性附着物，有时可见白色坏死斑，脾充血肿胀，给养殖业带来较大的经济损失，因此禽致病性大肠杆菌 O1血清型检测具有重要的意义。本试剂盒根据荧光定量 PCR原理开发，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供 DNA模板。

2、引物经过精心优化，专一性强，只扩增禽致病性大肠杆菌 O1血清型，与其他病原没有交叉反应。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、PCR mix中含上样染料，PCR后可以直接上样电泳。

5、本试剂盒足够做 40μL体系的 PCR 50次，但只能用于科研。

规格及成分

成份	编号	五孔盒包装
PCR MagicMix 3.0	90805	1 mL(红盖)
超纯水	100935	1 mL(紫盖)
禽致病性大肠杆菌 O1血清型PCR引物混合液	yw13-63500	100 μL(白盖)
禽致病性大肠杆菌 O1血清型PCR阳性对照(1×107拷贝/μL)	pc63500-AB369276.1	50 μL(黄盖)
使用手册	13-63500sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂

样品DNA

使用方法

一、样品DNA的制备

1、如果有N个病毒样品，必须设置N+2个提取反应，多出的两个中一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL禽致病性大肠杆菌 O1血清型PCR阳性对照(1×10⁷拷贝/μL，本试剂盒提供)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

2、用自选方法纯化上述N+2个样品的DNA。本试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。也可以选用本公司的细菌核酸提取试剂盒或免提取核酸释放剂。

二、设置PCR反应(40μL体系)

3、标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的DNA样品，额外增加的两个管一个用于PCR阳性对照，另一个用于PCR阴性对照。按照下表在各PCR管中加入下列成分：

成份	N+2个样品管	PCR阴性对照	PCR阳性对照
PCR MagicMix 3.0	各20 μL	20 μL	20 μL
禽致病性大肠杆菌 O1血清型PCR引物混合液	各2 μL	2 μL	2 μL
制备的N+2个DNA样品	各18 μL	不加	不加
超纯水	不加	18 μL	不加
禽致病性大肠杆菌 O1血清型PCR阳性对照的10倍稀释液	不加	不加	18 μL

4、上机进行PCR，PCR反应参数为:

过程	温度	时间
预变性	94℃	5分钟
PCR反应(40个循环)	94℃	30秒
	50℃	30秒
	72℃	30秒
延伸	72℃	5分钟

三、电泳分析

5、取10-20uL扩增产物进行常规琼脂糖电泳，检测扩增效果，由于扩增产物较短，建议用1.5%-2.0%的琼脂糖凝胶。

6、阳性样品预期得到的扩增产物长度为261bp。如果两个阴性对照(样品制备阴性对照或PCR阴性对照)有此扩增产物，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析实验结果。

7、如果所有样品和PCR阳性对照均无此扩增产物，则说明有系统性的问题(试剂，设备，程序，操作等)，需要重复并排查原因。

8、如果没有上述两种情况，则实验有效，可以分析样品的扩增结果。N+2个样品中扩增产物的判断为阳性，无则判定为阴性。