半岛bd体育手机客户端 及特点

非洲马瘟病毒(African Horse Sickness Virus，AHSV)会引起非洲马瘟，是一种马属动物的急性或亚急性传染病，该病以发热、皮下结缔组织与肺水肿以及内脏出血为特征，只能通过昆虫传播。马对此病的易感性最高，病死率高达 95%。本病发生有明显的季节性和地域性，多见于温热潮湿季节，常呈地方流行或暴发流行，传播迅速，因此灵敏快捷的诊断半岛bd体育手机客户端 具有重要的意义。本公司半岛bd体育手机客户端 开发非洲马瘟病毒染料法荧光定量 RT-PCR试剂盒，它具有下列特点：

1、一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2、根据非洲马瘟病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3、基于染料法 qRT-PCR检测，灵敏度比常规 RT-PCR高 10-100倍，可以达到至少 1000拷贝/反应。

4、使用一管式 qRT-PCR技术，RT和 PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 30μL体系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分

成份	编号	十孔盒包装
2×qRT-PCR缓冲液	190101a	500 μL(棕色管)
10×qRT-PCR酶混合液	190101b	100 μL(红盖)
ROX染料 I，50×	190101c	20 μL(棕色管)
ROX染料 II，50×	190101d	20 μL(棕色管)
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1mL(黄盖)
非洲马瘟病毒染料法 qRT-PCR引物混合液	14-10900yw	100 μL(白盖)
非洲马瘟病毒染料法 qRT-PCR阳性对照 (1×108拷贝/μL)	60908-10900pc	50 μL(黄盖)
核酸释放剂(试用装)	61202	20次(1mL，绿盖)
使用手册	14-10900sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供 DNA片段作为阳性对照。

自备试剂

样品 RNA

使用方法

一、稀释阳性对照(以 10²-10⁷这 6个 10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原。

1、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL荧

光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

2、在 7号管中加入 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

3、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

4、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 RNA的制备

5、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4号(浓度为 1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于 1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

6、用自选方法纯化 N+2个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20次免 RNA提取的核酸释放剂试用装。

三、设置 RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

7、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6个标曲反应缩减成 1个，其余不变。

8、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：

成分	N+2个制备所得样品	qRT-PCR阴性对照	qRT-PCR阳性对照(2-7管)
2×qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各 10μL
非洲马瘟病毒染料法qRT-PCR引物混合物	2μL	2μL	各 2μL

50×ROX (见注)	0.4μL	0.4μL	各 0.4μL
样品制备所得 RNA模板(来于第 8步)	5.6μL	-	-
稀释所得 6个阳性对照(来于第 6步)	-	-	各 5.6μL(2号样到 2号管，3号样到 3号管…)
超纯水	-	5.6μL	-
10×qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL

注:需使用 ROX染料 I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、 Step-One、Step-One Plus。

需使用 ROX染料 II的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用 ROX的机型 ： Thermal Cycle Dice Real Time System ， LightCycler 、 Smart Cycler System 、 Agilent Mx3000P 、 RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9、上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因半岛游戏平台官网入口网址 不同而需优化)。

过程	温度	时间
RT(逆转录)	50℃	15-30 min
预变性	95℃	5 min
qRT - PCR反应(40个循环)	95℃	15 sec
qRT - PCR反应(40个循环)	58℃	1 min(采集 FAM通道的荧光信号)
按半岛游戏平台官网入口网址 预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理

10、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

11、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性，如果小于 40，则为阳性。