半岛bd体育手机客户端 及特点

腺伴随病毒(Adeno-associated Virus，AAV)属细小病毒科，病毒颗粒直径为 20nm，无包膜，20面体，为目前动物病毒中最简单的一类单链线状 DNA病毒。在普通人群中，AAV感染率很高，85%的人呈血清抗体阳性，但是未发现 AAV引起人体疾病，甚至早年的流行病学研究报告认为，AAV感染者减少了患癌的危险性，对人体医学研究具有重要意义，因此快速检测腺伴随病毒具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本半岛bd体育手机客户端 就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测腺伴随病毒属细菌的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2、引物和探针经过优化，灵敏性高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据腺伴随病毒DNA的高度保守区设计，insilico分析发现其不会跟其他非腺伴随病毒的DNA发生交叉反应。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

6、既可用于定性，又可用于定量，用于定量时线性范围至少有5个数量级。

7、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分	编号	五孔盒包装
2×Probe qPCR MagicMix	190303	500uL(本色盖)
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(红盖)
超纯水	100935	1 mL(紫盖)
腺伴随病毒探针法qPCR引物-探针混合液	yp15-62400	150μL(棕色管)
腺伴随病毒探针法qPCR阳性对照(1×107拷贝/μL)	pc62400	50 μL(黄盖)
使用手册	15-62400sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂

样品DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以10-10⁶拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1、标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。

2、用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在6号管中加入5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7、如果有N个样品，**设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL第4号稀释液(第6步所得)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样本制备PC。另外用水作为样本制备NC。

8、用自选方法纯化样品的DNA，本扩增试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。

三、ProbeqPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(可直接用第6步所得的第4号稀释液)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管 N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线样品管 (1-6管)
2×ProbeqPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各10 μL
腺伴随病毒探针法qPCR引物-探针混合液	3 μL	3 μL	各3 μL
N+2个待测DNA模板	7 μL	不加	不加
超纯水	不加	7 μL	不加
第6步所得标准曲线样品稀释液(1-6号)	不加	不加	各7μL(1号样到1号管，2号样到2号管…)

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	3 min
PCR反应(45个循环)	95℃	15sec
	60℃	60sec(采集FAM通道的荧光信号)

五、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。