半岛bd体育手机客户端 及特点

腺伴随病毒(Adeno-associated Virus，AAV)属细小病毒科，病毒颗粒直径为20nm，无包膜，20面体，为目前动物病毒中最简单的一类单链线状 DNA病毒。在普通人群中，AAV感染率很高，85%的人呈血清抗体阳性，但是未发现 AAV引起人体疾病，甚至早年的流行病学研究报告认为，AAV感染者减少了患癌的危险性，对人体医学研究具有重要意义，因此腺伴随病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，为此本公司开发了简单快捷的腺伴随病毒染料法荧光定量 PCR检测试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供病毒样品。

2、根据腺伴随病毒保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。

3、灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4、一管式荧光定量 PCR检测，避免后续污染。

5、本试剂盒足够 50次 20μL反应体系的荧光定量 PCR。

6、本半岛bd体育手机客户端 只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装
2×qPCR MagicMix	90408	500μL(棕色管)
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
腺伴随病毒 PCR引物混合物	14-62400yw	100μL(白盖)
腺伴随病毒 PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	14-62400pc	50μL(红盖)
DNA病毒裂解液(试用装)	3674a	15次(9 mL)
使用手册	14-62400sc	1份

运输及保存

低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

DNA模板、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。

使用方法

一、稀释 PCR阳性对照(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)

1、注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA片段作为阳性对照。

2、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液(**用带芯枪头，下同)。

4、在 7号管中加入 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照，充分震荡 1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照到 5号管中，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

8、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL上步制备的 PCR阳性对照的第 4号(浓度为 1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于 1万拷贝)或第 5号(浓度为 1×10⁵拷贝/μL，10μL相当于 10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL样品，则 PC和 NC的体积也必须是 200μL。

9、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout或其升级版柱式病毒 DNAout。本试剂盒免费赠送 15次一管式病毒 DNAout。

三、设置 qPCR反应(20 μL体系，在样品制备室进行)

10、如果只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，6个用于 PCR阳性对照。如果做 2-3次重复，则反应设置数量相应增加 2或 3倍。

11、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管N+2个	PCR阴性对照管	PCR阳性对照管(2-7管)
2×qPCR MagicMix(棕色管)	10 μL	10 μL	各 10 μL
腺伴随病毒 PCR引物混合液(白盖)	2 μL	2 μL	各 2 μL
自备 10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2待测样品 DNA模板	6 μL	不加	不加
第 7步所得 PCR阳性对照稀释液(2-7号)	不加	不加	各 6μL(2号样到2号管，3号样到 3号管…)

注:仅 ABI7500、7700和 7900半岛游戏平台官网入口网址 需要使用 ROX作为对照，其他荧光 PCR半岛游戏平台官网入口网址 (如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和 LightCycler480)不需要使用 ROX，则用水替代。

12、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR(具体 PCR参数可以根据半岛游戏平台官网入口网址 不同而自行优化)。

过程	温度	时间
预变性	90℃	5分钟
PCR反应(30个循环)	92℃	60秒
PCR反应(30个循环)	56℃	60秒
PCR反应(30个循环)	74℃	60秒

13、数据采集

具体操作按所用半岛游戏平台官网入口网址 推荐的流程进行。本半岛bd体育手机客户端 中所含的荧光染料在不结合 DNA时，最大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA时的最大吸收光谱在 500 nm，最大发射光谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

四、数据处理

14、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

15、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性，如果小于 40，则为阳性。