半岛bd体育手机客户端 及特点

莱氏无胆甾原体属于柔膜体纲，支原体目，无胆甾原体科，无胆甾原体属。

莱氏无胆甾原体最初分离自污水、肥料、腐土质、土壤和植物组织，后来人们发现在牛生殖道和鼻腔、猪鼻腔、人口腔、鸡窦等各种哺乳动物和鸟类中均发现其寄生现象。莱氏无胆甾原体也是常见的污染细胞的支原体之一。荧光定量 PCR是检测传染性疾病的主流技术，本半岛bd体育手机客户端 就是以荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测莱氏无胆甾原体的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品 DNA模板。

2、引物经过优化，灵敏性高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据莱氏无胆甾原体高度保守区设计，不会跟其他病原DNA发生交叉反应。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的探针法荧光定量 PCR反应。

6、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装
2×qPCR Magic Mix	90408	500 μL(本色盖)
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
莱氏无胆甾原体染料法 qPCR引物混合物	14-75400yw	100 μL(白盖)
莱氏无胆甾原体染料法 qPCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	60908-75400pc	50 μL(黄盖)
使用手册	14-75400sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 DNA。10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。

1、注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

2、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

4、在 7号管中加入 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

7、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

8、如果有 N个样品，**设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

9、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA提取试剂盒兼容。

三、设置 qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

10、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

11、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线样品管(2-7管)
2×qPCR MagicMix(棕色管)	10 μL	10 μL	各 10 μL
莱氏无胆甾原体 PCR引物混合物(白盖)	2 μL	2 μL	各 2 μL
自备自备 10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2个待测 DNA模板	6 μL	不加	不加
第 7步所得 PCR阳性对照稀释液(2-7号)	不加	不加	各 6 μL(2号样到2号管，3号样到3号管…)

注:仅 ABI7500、7700和 7900半岛游戏平台官网入口网址 需要使用 ROX作为对照，其他荧光 PCR半岛游戏平台官网入口网址 (如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000和 LightCycler480)不需要使用 ROX，则用水替代。

12、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	5 min
PCR反应(30个循环)	94℃	60sec
PCR反应(30个循环)	55℃	60sec
PCR反应(30个循环)	72℃	60sec

13、具体操作按所用半岛游戏平台官网入口网址 推荐的流程进行。本半岛bd体育手机客户端 中所含的荧光染料在不结合 DNA时，最大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA时的最大吸收光谱在 500 nm，最大发射光谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

四、数据处理

14、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

15、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。若重复结果 Ct值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。