Golden Gate 组装用户须知：BsaI-HFv2（NEB #R3733）针对 Golden Gate 组装* 进行了优化。BsaI-HFv2 同样适用于任何需要使用 BsaI 切割 DNA 的实验流程。任何需要在 5′-GGTCTC(N1)/(N5)-3′ 识别序列处进行酶切的推荐用酶。

*Golden Gate 组装过程中对 DNA 酶切的要求比传统 DNA 克隆更为严苛。用于 Golden Gate 组装的限制性内切酶必须可以在酶的非最适缓冲液中反应良好，并在动态的酶切/重新连接反应中，在内切酶与连接酶竞争性结合底物的前提下，在更高的反应温度下，延长酶切时间，仍然拥有活性。大量测试表明，在具有挑战性的 Golden Gate 组装实验（限制性内切酶酶切效率和保真性至关重要）中，相较于 BsaI（NEB #R0535）和 BsaI-HF（NEB #R3535），BsaI-HFv2 的性能更优越。

高保真（HF?）限制性内切酶具有与天然酶相同的特异性，但经过改造后显著降低星号活性，并使用统一的缓冲液（rCutSmart? 缓冲液）。所有 HF 限制性内切酶均随附 6X 紫色凝胶上样染料。经过改造的内切酶与天然内切酶相比较，虽然价格相同，但性能和性价比更高：

• 为提高性能进行基因工程改造
• 用于 Golden Gate 组装；在常用于此用途的 T4 DNA 连接酶缓冲液中保持高活性水平
• IIS 型限制性内切酶能识别非回文 DNA 序列，并在识别序列之外进行切割
• 在 rCutSmart 缓冲液中具有 100% 活性
• 符合省时酶（Time-Saver?）标准，可在 5-15 分钟内完成酶切
• 降低星号活性
• NEB 开发了便捷的 Golden Gate 组装试剂盒（使用 BsmBI-v2 和 BsaI-HFv2）。
• 限制性内切酶酶切位点：GGTCTC(1/5)

“我真的很喜欢 BsaI-HFv2。我们再次获得了惊人的 GGA 结果，背景极低。”

- 美国北卡罗来纳州戴维森学院**研究员 M.C

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大肠杆菌菌株，携带有克隆自嗜热脂肪芽孢杆菌（ Bacillus stearothermophilus）6-55（Z. Chen）并经修饰的 BsaI 基因

• 特性和用法

  单位定义

  一个单位是指在 50 ?l 的总反应体系中，37℃ 条件下，1 小时内酶切 1 ?g pXba DNA 所需的酶量。

  反应条件

  1X rCutSmart? 缓冲液
  Incubate at 37℃

  1X rCutSmart? 缓冲液
  50 mM Potassium Acetate
  20 mM Tris-acetate
  10 mM Magnesium Acetate
  100 ?g/ml Recombinant Albumin
  (pH 7.9 @ 25℃)

  在不同缓冲液中的活性

  NEBuffer? r1.1: 100%
  NEBuffer? r2.1: 100%
  NEBuffer? r3.1: 100%
  rCutSmart? Buffer: 100%

  稀释兼容性

  • 稀释液 B

  贮存溶液

  10 mM Tris-HCl
  200 mM NaCl
  1 mM DTT
  0.1 mM EDTA
  200 ?g/ml Recombinant Albumin
  50% Glycerol
  pH 7.4 @ 25℃

  热失活

  80℃ for 20 minutes

  甲基化敏感性

  dam甲基化: 不敏感
  dcm甲基化: 某些甲基化与酶切位点的重叠组合影响酶切
  CpG甲基化: 某些甲基化与酶切位点的重叠组合阻断酶切

  同裂酶

  Bso31I
  BspTNI
  Eco31I
  

• 注意事项
  1. BsaI-HFv2 的特异性与 BsaI（NEB #R0535）相同，但经过改造后星号活性降低。
  2. 某些 dcm 甲基化与酶切位点的重叠组合影响酶切，某些 CpG 甲基化与酶切位点的重叠组合阻断酶切。