半岛bd体育手机客户端 说明

应用

聚凝胺是一种阳离子聚合物，可以大大提高逆转录病毒或慢病毒感染哺乳动物细胞的效率。它起到中和病毒体与细胞表面之间电荷排斥的作用，从而提高感染效率。逆转录病毒感染的效率在某些细胞中显著提高了 100 到 1,000 倍，这是因为在感染过程中加入了聚凝胺。含有 DMSO 的聚凝胺储液还用于介导 DNA 转移到多种细胞类型中，例如 CHO、鸡胚成纤维细胞、NINH-3T3 和髓样细胞。


方法：逆转录病毒感染


重组逆转录病毒储液是通过将 5ml 生长培养基(含 5％ 血清)添加接近汇合的转染的逆转录病毒包装细胞单层细胞的 100mm 平板中来制备的。24 小时后，去除培养基，并通过 0.45um 过滤器过滤。


将要感染该重组逆转录病毒储液的细胞以每个 100mm 平板 500,000 个细胞的量接种在 10ml 完全培养基中。


24 小时后，去除细胞的生长培养基。用 2ml 的病毒上清液(或将病毒储液稀释至 2ml)感染细胞，每毫升添加 5ug 至 10ug 的聚凝胺(最终浓度)，在 37℃ 下孵育细胞 3 到 6 小时。


加入 8 ml 完全培养基。感染三天后，将细胞按 1：5 的比例分进选择培养基。



方法：转染


将细胞铺在完全生长培养基中，约有 50％ 汇合。


铺板后 18 至 24 小时，立即使用以下方法制备 DNA-培养基-聚凝胺溶液：


注意：必须按照正确的顺序添加每个组件。

1：完全生长培养基(60mm 平板，2ml；

100mm 平板，3ml)，加热至 37℃。

2：质粒 DNA，10ng 至 10ug。轻轻混合。

3：聚凝胺的最终浓度为每毫升 5ug 至 10ug。轻轻混合


从平板中去除培养基，并将 DNA-培养基-聚凝胺溶液添加到细胞中。让细胞在 37℃ 下孵育 6 到 20 小时，前 6 个小时大约每 1.5 个小时轻轻摇动一次。


去除 DNA-培养基-聚凝胺溶液，并用 DMSO 储液轻轻覆盖细胞(在 1X HBSS 中的 15％ DMSO：专门培养基(货号 S-051-D)每个 60 mm 平板 3 ml，每个 100 mm 平板 4 ml。手动摇动培养皿 10 秒钟，使溶液均匀分布，然后将细胞置于 37℃ 下温育 4 分钟。


立即去除 DMSO 储液，并用完全生长培养基轻轻冲洗细胞两次，每个 60 mm 培养皿每次洗涤用 5 ml，每个 100 mm 培养皿每次洗涤用 10 ml


将完全生长培养基添加到细胞中。


若要获得稳定的转化子，则去除生长培养基，并将细胞按 1：5 比例分进选择培养基。


若要瞬时表达，去除生长培养基并添加新鲜的生长培养基。24 至 72 小时后收获细胞和/或培养基。


提供的试剂通过0.2μm膜过滤并用无菌H₂O水化。

外形

每毫升无菌超纯水溶解 10mg 聚乙烯。

储存及稳定性

在 -20°C 可保存长达 2 年。

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