实验报告：

一、NG108-15 [ 108CC15 ](小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞)分离与培养：

    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；

    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；

    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、免疫荧光鉴定：

    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃箱中孵育细胞过夜；

    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

    6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。

细胞特性：

1)组织来源于实验动物的正常眼组织。

2)细胞鉴定：细胞角蛋白-18(CK-18)免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：上皮样，不规则细胞，贴壁培养。

注意事项：

1、观察细胞zui好在低倍镜（4或5X物镜)下进行，否则不能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X或20X物镜下。

2、瓶中运输培养基不能重复再用,请换用加双抗的新培养基，细胞冻存后,培养基中可不加任何抗生素。

3、有些细胞贴壁不牢，如发现贴壁细胞有脱落，可离心吹打后接种到新瓶内。

4、收到细胞后，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请及时与我们。

MTX2(Metaxin-2) ELISA KitRat P4ha1(Prolyl 4-hydroxylase subunit alpha-1) ELISA KitO-苄基-L-酪氨酸体液基质金属蛋白酶（MMP）总活性比色法定量检测试剂盒

WIPI2 ELISA KitRat Atp6ap2(Renin receptor) ELISA KitO-苄基-L-酪氨酸细胞基质金属蛋白酶（MMP-1）活性荧光定量检测试剂盒

WIT1 ELISA KitRat Hspa8(Heat shock cognate 71 kDa protein) ELISA KitO-苄基-L-酪氨酸组织基质金属蛋白酶（MMP-1）活性荧光定量检测试剂盒

WNK4 ELISA KitRat Calb1(Calbindin) ELISA Kit2-辛酮体液基质金属蛋白酶（MMP-1）活性荧光定量检测试剂盒

WNT3(Proto-oncogene Wnt-3) ELISA KitRat Rnls(Renalase) ELISA Kit1-辛醛细胞基质金属蛋白酶（MMP-1）活性比色法定量检测试剂盒

WRAP53 ELISA KitRat Slc30a1(Zinc transporter 1) ELISA Kit草酰乙酸组织基质金属蛋白酶（MMP-1）活性比色法定量检测试剂盒

WDR81 ELISA KitRat LDL(Low-density lipoprotein) ELISA Kit土霉素二水合物体液基质金属蛋白酶（MMP-1）活性比色法定量检测试剂盒

WRN ELISA KitRat Cdk16(Cyclin-dependent kinase 16) ELISA Kit土霉素二水合物细胞基质金属蛋白酶（MMP-2）活性荧光定量检测试剂盒

NCOA7 ELISA KitIKK alpha + IKK beta  KB抑制蛋白激酶α/β抗体反式-4-苯基-3-丁烯-2-酮胆进口/国产PIG3/TP53I3  p53诱导蛋白3抗体含量：TLC法检查用

NEDD4L ELISA KitMC3 Receptor  黑素皮质素受体3抗体反式-4-苯基-3-丁烯-2-酮琥珀胆进口/国产PRMT4  组蛋白氨酸转移酶CARM1抗体含量：检查

HK1(Hexokinase-1) ELISA KitPDGF AB+BB  血小板源性生长因子AB+BB抗体2,3,4,6-O-四特戊酰基-ALPHA-D-溴代吡喃葡萄糖吡酸进口/国产TP53I13  肿瘤蛋白p53诱导蛋白13(肿瘤抑制因)含量：检查

NEK3 ELISA KitCPLA2  胞浆型磷脂酶A2抗体2,3,4,6-O-四特戊酰基-ALPHA-D-溴代吡喃葡萄糖泼尼松龙进口/国产p53 DINP1  p53诱导核蛋白1抗体含量：含量测定

NEK11 ELISA KitTIRAP  白细胞介素1受体衔接蛋白抗体三羟甲基丙烷上进口/国产p73 alpha  p53相关蛋白P73α抗体含量：HPLC含量测定

NDUFS1 ELISA Kitphospho-TIRAP(Tyr86)  磷酸化白细胞介素1受体衔接蛋白抗体柠檬黄维生D2进口/国产Frizzled 1/Wnt receptor  Wnt信号受体蛋白抗体含量：含量测定

NEK9 ELISA KitTNIP2/ABIN2/TNFAIP3 interacting protein 2  肿瘤坏死因子α诱导蛋白3相互作用蛋白2抗体2-硫脲嘧啶维生K1进口/国产GNAT3  G蛋白转录因子α3抗体含量：含量测定

NDUFS3 ELISA KitAzurocidin/Cationic antimicrobial protein 37  肝素结合蛋白/阳离子抗菌蛋白37/天青杀素抗体2-硫脲嘧啶咪替进口/国产GPR124  G蛋白偶联受体124抗体（肿瘤血管内皮标记物）含量：鉴别

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。