在抗体药物的血药浓度定量分析中，使用配体结合的传统方法进行测定时，必须针对目标药物制备具有高度特异性和亲和性的检测抗体，并且确立分析方法也需要耗费大量的时间和费用。而使用LC/MS/MS进行分析，由于不需要制备抗体，不仅大幅度缩短了分析方法的创建时间，还可以降低成本。本文向您介绍使用Skyline软件¹⁾和LCMS-8050/8060创建MRM方法，对生物样品中的单克隆抗体进行特异性检测的分析示例。
免疫球蛋白的基本结构是由分子量约23,000Da的轻链和分子量50,000～70,000Da的重链构成，不同物种之间氨基酸序列保持一致称为保守区域，各抗体分子中不同氨基酸序列部分被称为可变区。在可变区中，规定抗原识别特异性的区域被称为互补决定区CDRs)。该区域在抗体分子间的氨基酸序列存在多样性。免疫球蛋白中，重链和轻链分别含有3处CDRs(图1、2)，为了将血液样品中的抗体药物等单克隆抗体与内源性抗体区分开定量，必须选择性地检测CDRs。
1) Skyline是由华盛顿大学的MacCoss Lab of Biological Mass Spectrometry开发的软件。

图1 免疫球蛋白的结构和互补性决定区(CDRs)

图2 β淀粉样蛋白抗体(6E10)的氨基酸序列和CDRs

将全长单克隆抗体的氨基酸序列信息(FASTA文件)导入到Skyline中，预测因酶解产生的肽碎片。然后选择位于CDRs的肽肽段，并将所有预测的离子对和碰撞能量作为LabSolutions LCMS的分析方法进行输出。

图3 使用Skyline 创建分析方法(选择含CDRs 的胰酶解片段)

■使用Skyline 软件创建含CDRs 的胰酶酶解后肽段MRM 方法
本文向您介绍使用LCMS-8060/8050的LC/MS/MS法和Skyline¹⁾软件，对生物样品中单克隆抗体进行特异性检测创建肽的MRM方法和绘制标准曲线。只要有标准样品和氨基酸序列(含CDRs)的信息，通过组合Skyline和LCMS-8060/8050，即可在短时间内以较低的成本开发抗体药物的定量方法。
由于蛋白质分子量较大，进行LC/MS分析时，通常使用蛋白酶解使其成为碎片。为了使用MRM对生物样品中的蛋白质进行选择性测定，必须选择具有特异氨基酸序列的多肽片断酶解片段作为目标。
在此，以含有β淀粉样蛋白抗体(6E10)CDRs的多肽碎片为目标，使用经胰蛋白酶解的单克隆抗体标准样品创建了分析方法。使用Skyline软件和导入单克隆抗体的氨基酸序列，即可预测酶解产生的多肽氨基酸序列(图3)。此外，还可以预测多肽的母离子和碰撞能量以及因碰撞产生的子离子。根据上述预测信息，将位于CDRs区域的多肽片断的最佳半岛游戏平台官网入口网址 参数作为LabSolutions LCMS方法进行输出。
■使用LCMS-8050/8060和Skyline软件以优化分析方法
使用创建的分析方法测定经胰酶酶解的单克隆抗体。测定后数据文件将直接导入到Skyline，并自动选择高灵敏度的肽碎片和定量灵敏度高的离子对(图4)，由此筛选最佳定量分析条件。因此，LCMS-8050/8060和Skyline软件的组合使用，缩短定量分析方法的创建时间。

a)分别对检测到的肽进行强度比较 对前体离子的不同电荷数和子离子进行强度比较，选择了高灵敏度的目标离子。	b)各离子对的标准曲线的比较 选择了动态范围较大的531.27 > 603.32。
图4 使用单克隆抗体标样(6E10)的胰酶酶解样品检测含CDRs 的多肽片断(使用Skyline 进行数据分析)

a)代表性的含CDRs肽的MRM 色谱 b)代表性的含CDRs肽的分析参数	c)可简单选择检测灵敏度、直线性、动态范围良好的分析条件
图5 使用单克隆抗体标样(6E10)的胰酶酶解样品的分析结果

综上所述，使用Skyline创建的分析方法对单克隆抗体系列标准样品进行MRM测定。结果表明，在6.67～6670ng/mL(Injection vol.：30 μL)范围内得到了精确度良好的标准曲线。
注) ·本应用报告中记载的半岛bd体育手机客户端 并非并非为经国内相关法律批准和认证的医疗器械。
·请勿将本应用报告中记载的分析方法用于诊断目的。