PKR样内质网激酶（PERK）实验

购买GST-PERK胞质结构域。在Sf9昆虫细胞中，从杆状病毒中纯化6-His全长人eIF2α。eIF2α蛋白通过PBS透析进行缓冲液更换，NHS-LC-生物素对其进行化学修饰，eIF2α蛋白再通过50 mM Tris，pH 7.2，250 mM NaCl，5 mM DTT透析进行缓冲液更换。将蛋白分装，置于-80°C中储存。新鲜配制淬火溶液，加入反应液，终浓度分别为4 nM抗eIF2α磷酸化ser51抗体，4 nM Eu-1024标记的抗兔IgG，40 nM streptavidin Surelight APC和15 mM EDTA。反应在384孔聚苯乙烯低容量板中进行，终体积为10 μL。反应液包含10 mM HEPES，5 mM MgCl2，5 μM ATP，1 mM DTT，2 mM CHAPS，40 nM生物素化的6-His-eIF2α和0.4 nM GST-PERK。将分析化合物溶解于DMSO中，使其浓度达1.0 mM，使用DMSO进行11次系列稀释。将各浓度的分析化合物（0.1 μL）转移至分析板中。使终浓度为0.00017 ~ 10 μM。将GST-PERK溶液加到含化合物的分析板中，在室温下，将其预孵育30分钟。加入ATP和eIF2α开启反应。孵育1h后，加入淬火液。在室温下，将384孔板遮盖2小时，再测定信号。使用Viewlux读数仪定量分析信号。APC信号通过APC/Eu计算标准化至铕信号。每个被试物的结果均用IC50值表示。

细胞系

A459细胞

制备方法

在DMSO中的溶解度大于10 mM。若配制更高浓度的溶液，一般步骤如下：请将试管置于37℃加热10分钟和/或将其置于超声波浴中震荡一段时间。原液于-20℃可放置数月。

反应条件

0.003、0.1和0.3 μM；2小时

实验结果

在A459细胞中，GSK2606414抑制ERK自磷酸化，其IC50值少于0.3 μM。

动物模型

人胰腺癌BxPC3细胞异种移植模型

给药剂量

~ 150 mg/kg；口服给药

实验结果

在小鼠、大鼠以及犬中，GSK2606414具有较高的口服生物利用度和低至中度的血液清除。在携带人胰腺癌BxPC3细胞的小鼠中，GSK2606414呈剂量依赖性地抑制肿瘤生长。

其它注意事项

请于室内测试所有化合物的溶解度。虽然化合物的实际溶解度可能与其理论值略有不同，但仍处于实验系统误差的允许范围内。

References:

[1]. Axten JM, Medina JR, Feng Y, Shu A, Romeril SP, Grant SW, Li WH, Heerding DA, Minthorn E, Mencken T et al: Discovery of 7-methyl-5-(1-{[3-(trifluoromethyl)phenyl]acetyl}-2,3-dihydro-1H-indol-5-yl)-7H-p yrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amine (GSK2606414), a potent and selective first-in-class inhibitor of protein kinase R (PKR)-like endoplasmic reticulum kinase (PERK). J Med Chem, 55(16):7193-7207.