激酶实验

使用0.2 μM CDK–cyclin复合物进行放射性激酶活性测定。通常，在含有0.2 μM活性激酶的35 μl反应体积在激酶缓冲液中平衡，激酶缓冲液包含40 mM Hepes（pH 7.6）、34 mM NaCl、34 mM KCl、10 mM MgCl2、5％甘油和1×PhosSTOP。加入预冷的ATP至终浓度为200 μM和3μCi[γ-32P] ATP和50 μM含有5个磷酸化位点的底物肽，并将反应混合物在30℃、350 rpm的恒温混合器中温育30分钟。通过加入终浓度为50 mM的EDTA来终止反应。使用Optitran BA-S85增强膜将各15 μl的样点等分到纸方块上。用0.75％（v/v）磷酸将纸方块洗涤3次，持续5分钟，每个纸方块至少使用5 ml洗涤溶液。在Beckman扫描计数器（Beckman Coulter）中计数放射性1分钟。将化合物THZ531以不同浓度加入到0.2 μM CDK–cyclin复合物中，并在30℃和350 rpm下孵育1至540分钟，然后将ATP和底物加入到反应混合物中。

细胞系

Jurkat细胞

溶解方法

该化合物可溶于DMSO。若获取更高浓度的溶液，可在37℃下孵育10分钟，随后在超声波浴中摇匀。-20℃以下可储存数月。

反应条件

50-1200 nM，6 h

应用

THZ531导致Jurkat细胞增殖的显著和不可逆的降低，IC50为50 nM。THZ531以剂量依赖性和时间依赖性方式增加亚G1期细胞含量。高剂量的THZ531造成明显的膜联蛋白V信号，72小时引发30-40％的膜联蛋白V染色细胞。THZ531选择性降低Ser2磷酸化水平，而对CTD pSer5或pSer7水平无明显影响。50 nM THZ531引起一小部分基因的表达丧失。

注意事项

由于实验环境的不同，实际溶解度可能与理论值略有不同，请测试室内所有化合物的溶解度。

References:

[1]. Zhang T, Kwiatkowski N, Olson C M, et al. Covalent targeting of remote cysteine residues to develop CDK12 and CDK13 inhibitors[J]. Nature chemical biology, 2016.