半岛bd体育手机客户端 及特点

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是革兰氏阴性菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜。霍乱弧菌是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高。属于国际检疫传染病。本半岛bd体育手机客户端 是根据 PCR原理开发的霍乱弧菌通用检测试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供 DNA模板。

2、引物经过精心优化，专一性强，只扩霍乱弧菌，与其他病原没有交叉反应。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、 PCR mix中含上样染料，PCR后可以直接上样电泳。

5、本试剂盒足够做 40μL体系的 PCR 50次，但只能用于科研。

规格及成分

成份	编号	十孔盒包装
PCR MagicMix 3.0	90805	1 mL(红盖)
超纯水	100935	1 mL(亮黄色)
霍乱弧菌通用 PCR引物混合液	13-14830yw	100 μL(白盖)
霍乱弧菌通用 PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	60908-14830pc	50 μL(黄盖)
使用手册	13-14830sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照需要单独放置，不要污染其他试剂。

自备试剂

样品 DNA。

使用方法

一、样品 DNA的制备

1、用自选方法纯化 N+2个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

2、如果有 N个样品，则需要做 N+2个提取，包括一个样品制备阳性对照和一个样品制备阴性对照。样品制备阳性对照是在适量水(取决于试剂盒要求的样品起始量)中加 10μL霍乱弧菌通用 PCR阳性对照的 10000倍稀释液而得，样品制备阴性对照是直接用水。提取结束后最后得到模板 DNA放冰上待用。

二、设置 PCR反应(40μL体系)

3、对 N+2个样品，在 PCR时需要增加一个 PCR阳性对照和一个 PCR阴性对照，故需要设置 N+4个反应。在 N+4个 PCR管中分别加入下列成分：

成分	N+2个样品管	PCR阴性对照	PCR阳性对照
PCR MagicMix 3.0	各 20 μL	20 μL	20 μL
霍乱弧菌通用 PCR引物混合液	各 2 μL	2 μL	2 μL
N+2个样品 DNA模板	各 18 μL	-	-
PCR阴性对照(水)	-	18 μL	-
PCR阳性对照(霍乱弧菌通用 PCR阳性对照的10000倍稀释液)	-	-	18 μL

4、按下表设置 PCR反应：

过程	温度	时间
预变性	95℃	5 min
PCR反应(35个循环)	95℃	30 sec
PCR反应(35个循环)	58℃	30 sec
PCR反应(35个循环)	72℃	30 sec
最后延伸	72℃	7 min

三、电泳检测

5、取 10-20 μL PCR产物。2%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。本半岛bd体育手机客户端 提供的 PCR Mix在扩增结束后可以直接上样，不需要另外再加 loading buffer。阳性对照必须有预期条带出现，阴性对照必须无任何扩增，否则实验无效。对没有扩增产物的样品，可以稀释 10倍后重复 PCR扩增以排除 PCR抑制剂的感染。