半岛bd体育手机客户端 及特点

隐孢子虫(Cryptosporidium)为体积微小的球虫类寄生虫，广泛存在多种脊椎动物体内，寄生于人和大多数哺乳动物的主要为微小隐孢子虫(C. parvum)，引起隐孢子虫病(cryptosporidiosis)，是一种以腹泻为主要临床表现的人畜共患性原虫病，因此对隐孢子虫进行快速灵敏的诊断具有重要的意义。本半岛bd体育手机客户端 就是根据隐孢子虫 rRNA编码基因的保守区设计引物而开发的高灵敏荧光定量 PCR半岛bd体育手机客户端 。本试剂盒具有下列特点：

1、根据隐孢子虫 OWP(oocyst wall protein)编码基因保守序列设计的专一性引物，与其他肠道疾病病原体(如B.hominis、E.coli、E.dispar、E.moshkovskii、 V.cholerae等)无交叉反应。

2、灵敏度比常规 PCR高 2-3个数量级，可以达到几十拷贝/反应。

3、即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。

4、一管式荧光定量 PCR检测，避免后续污染。

5、本试剂盒足够 100次 20uL反应体系的荧光定量 PCR。

6、本半岛bd体育手机客户端 只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装(去纸托)
2×qPCR MagicMix	90408	0.5 mL(装 A袋)
超纯水	100935	1 mL(装 A袋)
隐孢子虫 PCR引物 F	14-26800f	0.5 OD(装 B袋)
隐孢子虫 PCR引物 R	14-26800r	0.5 OD(装 B袋)
隐孢子虫基因阳性对照(1×108copy/μL)	14-26800pc	50 μL(装 C袋)
使用手册	11-3390sc	1份

运输及保存

低温运输、-20℃保存(A袋试剂放样品准备区、C袋的阳性对照**分开放置)，有效期一年。

自备试剂

DNA模板、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。

使用方法

一、样品 DNA的制备

1、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数原虫 DNA提取试剂盒兼容。本公司的柱式粪便 DNA提取试剂盒也可以用于隐孢子虫 DNA提取。

二、引物的制备(在样品制备室进行)

2、按引物标签提示在装引物干粉的管中直接加入适量的超纯水(加入量见引物试管上的标签)，使得两条引物的浓度均为 10μM(10pmol/μL)，然后各取 110μL混合在一起得 220μL，标注为引物混合物，放冰上待用。220μL足够 100次 qPCR反应。

三、稀释阳性对照(以 10²-10⁷这 6个 10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的长为 150bp的 DNA片段作为阳性对照。

3、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

4、用带芯枪头分别加入 45 μL超纯水(**用带芯枪头，下同)。

5、在 7号管中加入 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照，充分震荡 1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7、换枪头，从 6号管中取 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照到 5号管中，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

8、换枪头，从 5号管中取 5 μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照到 4号管中，得1×10⁴拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

9、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

四、设置 qPCR反应(20 μL体系，在样品制备室进行)

10、在 PCR管中加入下列成分(待测样品需要做三次重复，下表只列出一次。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品	阴性对照	阳性对照(2-7管)
2×qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
引物混合物	2 μL	2 μL	各 2 μL
自备 10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
待测样品 DNA模板	1-5 μL	不加	不加
阳性对照(2-7号)	不加	不加	各 5μL(2号样到2号管，3号样到 3号管…)
补水到	20 μL	20 μL	20 μL

注:仅 ABI7500、7700和 7900半岛游戏平台官网入口网址 需要使用 ROX作为对照，其他荧光 PCR半岛游戏平台官网入口网址 (如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和 LightCycler480)不需要使用 ROX。

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR(具体 PCR参数可以根据半岛游戏平台官网入口网址 不同而自行优化)。

过程	温度	时间
预变性	95℃	3分钟
PCR反应(45个循环)	95℃	30秒
PCR反应(45个循环)	55℃	30秒
PCR反应(45个循环)	72℃	30秒

12、数据采集

具体操作按所用半岛游戏平台官网入口网址 推荐的流程进行。一般在复性步骤采集荧光数据。本半岛bd体育手机客户端 中所含的荧光染料在不结合 DNA时，最大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA时的最大吸收光谱在 500 nm，最大发射光谱在 530 nm。

五、数据处理

13、以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。