半岛bd体育手机客户端 及特点

病毒性神经坏死病病毒(Viral Nervous Necrosis Virus，VNNV)是一种RNA病毒，会引起病毒性神经坏死病病毒病，患病鱼漂游于水面，并伴随有游泳不协调、螺旋状游泳等不同的神经症状，部分鱼眼盲，体弱，不摄食，体褪色或发黑，但未见出血或糜烂。该疾病流行于除美洲和非洲外几乎世界所有地区的海水鱼类，对仔鱼和幼鱼危害很大，严重者在一周内死亡率可达100%，且近年受感染的鱼类种类和受危害程度迅速增加，因此快速灵敏诊断具有重要意义。为此本公司开发了本半岛bd体育手机客户端 ，可用于在科研领域快速定量检测病毒性神经坏死病病毒。它具有下列特点。它具有下列特点：

1、一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2、根据病毒性神经坏死病病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3、灵敏度可以达到1000拷贝/反应。

4、使用一管式 RT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够50次20μL体系的RT-PCR。

6、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分

成份	编号	十孔盒包装
5×双酶一管式RT-PCR Buffer	91202a	200 μL(黄盖)
MMLV-Taq Mix	91202b	75μL(红盖)
超纯水	100935	1 mL(本色盖)
病毒性神经坏死病病毒RT-PCR引物混合液	13-53200yw	100 μL(白盖)
病毒性神经坏死病病毒PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	13-53200pc	50μL(黄盖)
核酸释放剂试用装	61202a	20次(1mL，绿盖)
使用手册	13-53200sc	1份

注：为避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供专一的RNA片段作为阳性对照。

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。收到货后阳性对照需要跟其他成分分开放置，因为其容易污染其他成分，造成假阳性。

自备试剂

样品RNA

使用方法

一、样品RNA的制备

1、如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL病毒性神经坏死病病毒PCR阳性对照的10000倍稀释的(稀释后浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝，可以将10μL原液加入到990μL自备TE溶液中，充分混匀，此为100倍稀释液。再取10μL此稀释液加入到990μL自备TE溶液中，充分混匀，此为10000倍稀释液)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品RNA。

2、用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20次核酸释放剂试用装。

二、设置RT-PCR反应(20μL体系)

3、如果有N+2个样品，则标记N+4个PCR管(额外增加的两个管一个是RT-PCR阳性对照，另一个是RT-PCR阴性对照)并按照下表在PCR管中加入下列成分：

成份	N+2个 样品管	RT-PCR阴性对照	RT-PCR阳性对照
5×双酶一管式RT-PCR Buffer	各4μL	4μL	4μL
病毒性神经坏死病病毒RT-PCR引物混合液	各2 μL	2 μL	2 μL
N+2个制备的RNA样品	各12.5μL	不加	不加
超纯水	不加	12.5μL	不加
病毒性神经坏死病病毒RT-PCR阳性对照的10000倍稀释液	不加	不加	12.5 μL
MMLV-Taq Mix	1.5μL	1.5μL	1.5μL

4、上机进行RT-PCR，RT-PCR反应参数为:

过程	温度	时间
逆转录	42℃	30分钟
预变性	95℃	5分钟
PCR反应(40个循环)	93℃	45秒
	55℃	120秒
延伸	72℃	5分钟

5、琼脂糖电泳检测扩增效果，阳性样品预期得到的扩增产物长度为270bp。如果阴性对照有此扩增产物或阳性对照无此扩增产物，则说明实验失败，需要分析实验失败的原因。只有在阴性对照没有此扩增产物、阳性对照有此扩增产物的情况下，才有必要分析样品的实验结果，如果有此扩增产物则为阳性，如果无则为阴性。