半岛bd体育手机客户端 及特点

白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)是引起小儿白喉的病原菌，属于棒状杆菌属(Corynebacterium)。菌体大小为(0.3～0.8μm)×(1～5μm)，细长稍弯，粗细不一，菌体一端或两端排列呈棒状，排列不规则，常呈L、V、X、T等字形或排成栅栏状。本菌的致病物质主要是白喉毒素，可尚产生一些侵袭性物质，如类似于结核杆菌的索状因子(Cord factor),能破坏细胞的线粒体膜，导致呼吸和氧化磷酸化作用受到抑制。

因此快速灵敏检测白喉棒杆菌具有重要意义。本半岛bd体育手机客户端 就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测白喉棒杆菌通用型的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2、引物和探针经过优化，灵敏性高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据白喉棒杆菌通用DNA高度保守区设计，不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应。

5、既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。

6、本半岛bd体育手机客户端 足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

7、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

格及成分

成分	编号	五孔盒包装
2×Probe qPCR MagicMix	190303	500 μL(红盖)
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(绿盖)
超纯水	100935	1 mL(白盖)
白喉棒杆菌探针法qPCR引物-探针混合液	15-15820yp	150μL(棕色管)
白喉棒杆菌探针法qPCR阳性对照(1×107拷贝/μL)	15820pc	50 μL(黄盖)
使用手册	15-15820sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂

样品DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以10E1-10⁶拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1、标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。

2、用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同。

3、在6号管中加入5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7、如果有N个样品待提取，**设置N+2个提取，多出的是PC(样品制备阳性对照)和NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的1000倍稀释液10μL再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为PC。另外用水作为NC。

8、用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。

三、ProbeqPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分/每管	样品管 N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线 样品管(1-6管)
2×ProbeqPCR MagicMix	10 μL	10 μL	10 μL
白喉棒杆菌探针法qPCR引物-探针混合液	3 μL	3 μL	3 μL
N+2个待测DNA模板	7 μL	-	-
超纯水	-	7 μL	-
第6步所得标准曲线样品稀释液(1-6号)	-	-	7 μL(1号样到1号管，2号样到2号管…)

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	10 min
PCR反应(45个循环)	95℃	15sec
	58℃	30 sec
	72℃	60sec(采集FAM通道的荧光信号)

四、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于38。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于38则为阳性。如果在38-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。