半岛bd体育手机客户端 及特点

椰子死亡性类病毒Coconut Cadang-Cadang Viroid(CCCVd)是一种具有传染性的单链RNA病原体。它比病毒要小，且没有典型病毒所有的蛋白质外壳。类病毒为严格寄生物，专一性很强，通常感染高等植物，并整合到植物的细胞核内进行复制。类病毒通常通过种子或花粉传播而椰子死亡性类病毒就是出现在椰子植物上和病毒。为此本公司开发了本半岛bd体育手机客户端 ，采用RT-PCR技术检测疑似感染动物血清或组织中的椰子死亡类病毒。它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。

2、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

3、半岛bd体育手机客户端 精心优化且特异性高，引物是根据椰子死亡类病毒RNA高度保守区设计，不会跟除此之外的其它病毒RNA发生交叉反应。

4、RT-PCR mix中含上样染料，扩增反应后可以直接上样电泳。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够50次20μL体系的PCR反应。

6、本半岛bd体育手机客户端 只能用于定性实验，不能用于定量。

7、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成份	编号	五孔盒包装
2×RT-PCR Buffer	91202A	500 μL(棕色管)
20×RT Enzyme Mix	91202B	50 μL(红盖)
超纯水	100935	1 mL(白盖)
椰子死亡类病毒RT-PCR引物混合液	13-1870yw	100 μL(绿盖)
椰子死亡类病毒RT-PCR阳性对照(1×106拷贝/μL)	1870pc	50 μL(黄盖)
使用手册	13-1870sc	1份

注：为避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供专一的核酸片段作为阳性对照。

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂

样品DNA

使用方法

一、样品DNA的制备

1、如果有N个样品，必须设置N+2个提取反应，多出的两个中一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL椰子死亡类病毒PCR阳性对照(1×10⁶拷贝/μL，本试剂盒提供)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

2、用自选方法纯化上述N+2个样品的DNA。本试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。

二、设置PCR反应(20μL体系)

3、标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的DNA样品，额外增加的两个管一个用于PCR阳性对照，另一个用于PCR阴性对照。按照下表在各PCR管中加入下列成分：

成分/每管	样品管 N+2个	PCR阴性对照	PCR阳性对照
2×RT-PCR Buffer	10 μL	10 μL	10 μL
椰子死亡类病毒PCR引物混合液	2 μL	2 μL	2 μL
制备的N+2个DNA样品	7 μL	-	-
超纯水	-	7 μL	-
椰子死亡类病毒PCR阳性对照的10倍稀释液	-	-	7 μL
20×RT Enzyme Mix	1 μL	1 μL	1 μL

4、上机进行PCR，PCR反应参数为:

过程	温度	时间
逆转录	50℃	20 min
预变性	95℃	10 min
PCR反应(45个循环)	95℃	30 sec
	55℃	60 sec
	72℃	60 sec
延伸	72℃	7 min

三、电泳分析

5、取5-10uL扩增产物进行常规琼脂糖电泳，检测扩增效果，由于扩增产物较短，建议用1.5%-2.0%的琼脂糖凝胶。

6、阳性样品预期得到的扩增产物长度为220bp左右。如果两个阴性对照(样品制备阴性对照或PCR阴性对照)有此扩增产物，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析实验结果。

7、如果所有样品和PCR阳性对照均无此扩增产物，则说明有系统性的问题(试剂、设备、程序、操作等)，需要重复并排查原因。

8、如果没有上述两种情况，则实验有效，可以分析样品的扩增结果。N+2个样品中有扩增产物的判定为阳性，无则判定为阴性。