半岛bd体育手机客户端 及特点

基孔肯尼雅病毒(Chikungunya Virus，CHIKV)是一种 RNA病毒，会引起基孔肯雅病，发热病人常突然起病，寒战、发热，体温可达 39℃，伴有头痛、恶心、呕吐、食欲减退，淋巴结肿大。一般发热 1～7天即可退热，约 3天后再次出现较轻微发热，持续 3～5天恢复正常，有些患者可有结膜充血和轻度结膜炎表现，关节疼痛与发热同时，患者全身的多个关节和脊椎出现十分剧烈的疼痛，且病情发展迅速，往往在数分钟或数小时内关节功能丧失，不能活动，因此灵敏快捷的诊断半岛bd体育手机客户端 具有重要的意义。本半岛bd体育手机客户端 根据 PCR原理开发，可用于科研领域快速检测基孔肯尼雅病毒。它具有下列特点：

1、一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2、根据基孔肯尼雅病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3、灵敏度可以达到 1000拷贝/反应。

4、使用一管式 RT-PCR技术，RT和 PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的 RT-PCR。

6、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分

成份	编号	十孔盒包装
5×双酶一管式 RT-PCR Buffer	91202a	200 μL(橘黄盖)
MMLV-Taq Mix	91202b	75 μL(红盖)
超纯水	100935	1 mL(亮黄盖)
基孔肯尼雅病毒 RT-PCR引物混合液	13-15100yw	100 μL(白盖)
基孔肯尼雅病毒 RT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	60908-15100pc	50 μL(黄盖)
核酸释放剂(试用装)	61202a	20次(1mL，绿盖)
使用手册	13-15100sc	1份

注：为避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供专一的 DNA片段作为阳性对照。

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。收到货后阳性对照需要跟其他成分分开放置，因为其容易污染其他成分，造成假阳性。

自备试剂

样品 RNA

使用方法

一、样品 RNA的制备

1、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL流行性出血热病毒PCR阳性对照的 100倍稀释作为制备的阳性对照；用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 RNA。

2、用自选方法纯化 N+2个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20次核酸释放剂试用装。

二、设置 RT-PCR反应(20μL体系)

3、如果有 N+2个样品 ，则标记 N+4个 PCR管 (额外增加的两个管一个是 RT-PCR阳性对照，另一个是 RT-PCR阴性对照)并按照下表在 PCR管中加入下列成分：

成份	N+2个样品管	RT-PCR阴性对照	RT-PCR阳性对照
5×双酶一管式 RT-PCR Buffer	各 4 μL	4 μL	4 μL
基孔肯尼雅病毒 RT-PCR引物混合液	各 2 μL	2 μL	2 μL
N+2个制备的 RNA样品	各 12.5 μL	-	-
超纯水	-	12.5 μL	-
基孔肯尼雅病毒 RT-PCR阳性对照的 100倍稀释液	-	-	12.5 μL
MMLV-Taq Mix	1.5 μL	1.5 μL	1.5 μL

4、上机进行 RT-PCR，RT-PCR反应参数为:

过程	温度	时间
逆转录	42℃	30 min
预变性	95℃	5 min
PCR反应(35个循环)	95℃	30 sec
PCR反应(35个循环)	57℃	30 sec
PCR反应(35个循环)	72℃	15 sec
延伸	72℃	7 min

5、琼脂糖电泳检测扩增效果。如果阴性对照有扩增产物或阳性对照无扩增产物，则说明实验失败，需要分析实验失败的原因。只有在阴性对照没有扩增产物、阳性对照有 122bp预期的扩增产物的情况下，才有必要分析样品的实验结果，如果有扩增产物则为阳性，如果无则为阴性。