半岛bd体育手机客户端 及特点

犬冠状病毒(Canine Corona Virus，CCoV )为单链 RNA病毒，有 6-7种多肽，其中 4种是糖肽，不含 RNA聚合酶及神经氨酸酶。可使犬发生程度不同的胃肠炎症状，特征有频繁呕吐、腹泻、沉郁、厌食等症状。本病一年四季均可发生，以冬季多发，病犬是主要的传染原，犬可通过呼吸道、消化道、粪便及污染物传染。该病一但发生，同窝犬同室犬很难控制均可造成感染。幼犬死亡率较高,对幼犬的危害较大。最近的研究发现 CCoV感染的宿主范围有不断扩大的趋势,许多野生动物如虎、狮、大熊猫、小熊猫、水紹也可感染。本半岛bd体育手机客户端 就是以探针法荧光定量 RT-PCR技术为基础开发的专门检测犬冠状病毒的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品 RNA模板。

2、引物和探针经过优化，灵敏性高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据犬冠状病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的 RNA发生交叉反应。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的探针法荧光定量 RT-PCR反应。

6、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装
探针法 qRT-PCR缓冲液	190504a	500μL(黄盖)
探针法 qRT-PCR酶混合液	190504b	100μL(红盖)
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
犬冠状病毒探针法 qRT-PCR引物混合液	15-27200yw	100 μL(白盖)
犬冠状病毒 qRT-PCR探针	15-27200pb	50 μL(棕色管)
犬冠状病毒探针法 qRT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	60908-27200pc	50 μL(黄盖)
使用手册	15-27200sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 RNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。

由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 RT-PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在 7号管中加入 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA的制备

7、如果有 N个样品，**设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8、用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。

三、Probe qRT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管 N+2个	RT-PCR阴性对照管	标准曲线样品管(2-7管)
探针法 qRT-PCR缓冲液	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
探针法 qRT-PCR酶混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
犬冠状病毒 qRT-PCR探针	各 1 μL	1 μL	各 1 μL
犬冠状病毒探针法 qRT-PCR引物混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
待测样品 RNA模板	各 5 μL	-	-
超纯水	-	5 μL	-
第 7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号)	-	-	各 5 μL(2号样到 2号管，3号样到 3号管…)

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 qRT-PCR：

过程	温度	时间
逆转录	50℃	30 min
预变性	94℃	10 min
qRT-PCR反应(40个循环)	94℃	15 sec
qRT-PCR反应(40个循环)	60℃	1 min(采集 FAM通道的荧光信号)

五、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性，如果小于 35，则为阳性。