半岛bd体育手机客户端 及特点

犬冠状病毒(Canine Corona Virus，CCoV)是一种RNA病毒，是一种严重危害养犬业、经济动物养殖业和野生动物保护的病毒性传染病病源，可使犬发生程度不同的胃肠炎症状，特征有频繁呕吐、腹泻、沉郁、厌食等症状。本病一年四季均可发生，以冬季多发，病犬是主要的传染原，犬可通过呼吸道、消化道、粪便及污染物传染。该病一但发生，同窝犬同室犬很难控制均可造成感染，因此灵敏快捷的诊断半岛bd体育手机客户端 具有重要的意义。本半岛bd体育手机客户端 基于PCR原理开发。它具有下列特点：

1、一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2、根据犬冠状病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3、基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。

4、使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分

成份	编号	十孔盒包装
2×qRT-PCR缓冲液	190101a	500 μL(棕色管)
10×qRT-PCR酶混合液	190101b	100 μL(红盖)
ROX染料I	190101c	50μL(棕色管)
ROX染料II	190101d	50μL(棕色管)
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1mL(亮黄盖)
犬冠状病毒RT-PCR引物混合液	14-27200 yw	100μL(白盖)
犬冠状病毒RT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	14-27200 pc	50μL(黄盖)
核酸释放剂试用装	61202	20次(1mL，绿盖)
使用手册	14-27200 sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供RNA片段作为阳性对照。

自备试剂

样品RNA

使用方法

一、稀释阳性对照(以10²-10⁷这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原。

1、标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

2、在7号管中加入5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

3、换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

4、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

5、如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

6、用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20次免RNA提取的核酸释放剂试用装。

三、设置RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

7、如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。

8、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：

成分	N+2个制备所得样品	RT-PCR阴性对照	RT-PCR阳性 对照(2-7管)
2×qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各10μL
口蹄疫病毒RT-PCR 引物混合物	2μL	2μL	各2μL
50×ROX (见注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
样品制备所得RNA模板(来于第8步)	5.6μL	不加	不加
稀释所得6个阳性对照(来于第6步)	不加	不加	各5.6μL(2号样到2号管，3号样到3号管…)
10×qRT-PCR 酶混合液	2μL	2μL	2μL

注:需使用ROX染料I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。

需使用ROX染料II的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9、上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因半岛游戏平台官网入口网址 不同而需优化)。

过程	温度	时间
RT(逆转录)	50℃	15-30分钟
预变性	94℃	2分钟
RT - PCR反应(30个循环)	95℃	15秒
	60℃	15秒(采集FAM通道的荧光信号)
	72℃	15秒
按半岛游戏平台官网入口网址 预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理

10、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。

11、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。