半岛bd体育手机客户端 及特点

本试剂盒可用于检测食品或其他材料中是否有牛的成分。现代食品加工工艺极大改变了食材原有的味道、气味、色泽、纹理和质地等特性，因此传统的感官鉴别技术已经无法对食材的真伪进行准确的鉴定。同时部分食材还有致敏性，因此基于基因检测的快速灵敏的食材来源检测技术将对食品监管和安全提供重要的保障。本半岛bd体育手机客户端 就是为满足这一需求根据 PCR原理开发的半岛bd体育手机客户端 ，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品 DNA。

2、根据牛保守区域设计引物，能专一性地检测出样品中的牛成分，但不能检测其他非牛成分。

3、荧光定量 PCR检测，比常规 PCR更加灵敏。

4、快速，整个检测过程(按一个样品计)所需时间仅为 2.0小时。

5、一管式闭管操作，降低了交叉污染。

6、提供阳性标准品，便于分析实验结果。

7、对混合样品中牛成分的检测下限为 0.1% ，对样品中牛成分的核酸检测下限为 1.0ng/μL。

8、本只能用于科研，足够 50次 20uL体系的荧光定量 PCR。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装(去纸托)
2×qPCR MagicMix	90408	0.5 mL(棕色)
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
牛源性成分 PCR引物混合液	14-122yw	100 uL(白盖)
牛源性成分 PCR阳性对照	14-122pc	50 uL(黄盖)
DNA释放剂试用装	130982	50次(成分见下)
免 DNA提取试剂溶液 A成分一	130982a	50 uL(白盖)
免 DNA提取试剂溶液 A成分二	130982	100uL(绿盖)
免 DNA提取试剂溶液 B	130982c	400 uL(红盖)
使用手册	13-510sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，有效期一年。使用本试剂盒提供的阳性对照时，由于其浓度较高，一定要注意不要污染其他试剂和成分。**在专门的区域操作。

自备试剂

DNA模板

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在 7号管中加入 5 μL阳性对照(浓度为 1×10⁸拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

7、用自选方法纯化样品的 DNA，本半岛bd体育手机客户端 跟市场上绝大多数核酸纯化半岛bd体育手机客户端 兼容。

8、如果有 N个样品，则需要进行 N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的 DNA释放剂试用装。则按下面步骤操作：

9、配制溶液 A工作液。以配制 1mL工作液(足够 10个样品)为例：在一干净塑料管中加入 10uL溶液 A成分一，20uL溶液 A成分二和 970uL超纯水，充分混合均匀即可。溶液 A工作液可室温放置，但**在一周内用完，不要长期放置。一次检测一个样品需要 100uL溶液 A工作液，1mL工作液足够 10个样品。如果待测样品数量为其他数字，配制的溶液 A工作液的体积需要做相应的调整。

10、在标记好的 N+2个离心管中，加入 1-5mg固体样品(半粒芝麻大小)或 5uL液体样品待测样品。在样品制备阳性对照中加入 5uL阳性对照，在样品制备阴性对照中加入 5uL水。

11、在每个管中加入 100 uL溶液 A工作液，确保固体样品被溶液淹埋，如果是液体样品则震荡混匀。

12、95℃保温 10分钟。

13、待冷却到常温后加入 10uL溶液 B并混匀得 DNA释放液。每个样品得到的 DNA释放液足够进行 50-100次 PCR。

三、设置 qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

14、如果只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品(也充当 PCR阳性对照)。如果做 2-3次重复，则反应设置数量相应增加 2或 3倍。

15、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线样品管(2-7管)
2×qPCR MagicMix(棕色管)	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
牛源型成分 PCR引物混合液(白盖)	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
自备 10×ROX (见注)	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
待测样品 DNA模板	各 6 μL	不加	不加
第 7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号)	不加	不加	各 6μL(2号样到2号管，3号样到 3号管…)

注:仅 ABI7500、7700和 7900半岛游戏平台官网入口网址 需要使用 ROX作为对照，其他荧光 PCR半岛游戏平台官网入口网址 (如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和 LightCycler480)不需要使用 ROX，则用水替代。

16、盖上盖子后上机，按下面参数进行 qPCR(具体 PCR参数可以根据 qPCR半岛游戏平台官网入口网址 的不同而自行优化)。

四、qPCR反应参数

过程	温度	时间
预变性	94℃	5 min
PCR反应(35个循环)	94℃	0.5 min
PCR反应(35个循环)	60℃	0.5 min(采集 SYBR通道的荧光信号)
PCR反应(35个循环)	72℃	0.5 min
最后延伸	72℃	10 min

五、数据处理

17、设定 60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。

18、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

19、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性，如果小于 40，则为阳性。

六、电泳检测

20、如果有必要电泳确认，可取 10-20 μL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为 150bp。开盖电泳验证容易污染实验环境，强烈不建议采用此方法。